猪圆环病毒2型检测技术研究进展

宋大贺，孙晓飞，贾　赟，孙　燕

（1.大连机场出入境检验检疫局，辽宁　大连　116001；2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁　大连　116001；3.大连森林动物园，辽宁　大连　116000)

猪圆环病毒2型检测技术研究进展

宋大贺1，孙晓飞2，贾赟2，孙燕3

（1.大连机场出入境检验检疫局，辽宁大连116001；2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001；3.大连森林动物园，辽宁大连116000)

猪圆环病毒病（Porcine Circovirus Diseases，PCVDs）的临床特征和系统病理损伤与其他疾病十分相似，很难根据临床症状做出正确的诊断，因此实验室对猪圆环病毒2型（Porcine Circovirous Type2，PCV2）的检测结果成为了诊断的重要依据之一，本文将对实验室检测PVC2经常采用的血清学和分子生物学检测技术进行概述与比较。

PCV2；检测技术；血清学；分子生物学

1　猪圆环病毒的病原学特征

猪圆环病毒（porcine circovirous，PCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，其直径约12～23 nm，呈二十面体对称，无囊膜，共价键闭合，为单股环状DNA病毒，相对分子量为36 kDa，是已知最小的动物病毒[1-2]，PCV根据致病性、抗原性和基因序列差异，将PCV分为PCV1和PCV2两型。研究表明，PCV1暂不具有治病性，而PCV2则具有较强的治病性，通常被认为是引起与猪圆环病毒相关疾病的主要病原。PCV2主要分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e五种基因型亚群[3-4]，其中，PCV2a和PCV2b是主要类型，又因为PCV2b在自然感染中流行，所以PCV2b被认为致病性最强[5-7]。

2　PCV2的致病机理

PCV2的致病机理十分复杂，目前还没有研究清楚，但是一些相关研究表明，单独感染猪圆环病毒不足以引起仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），必须有其他的因素参与才能发生[8-11]。PCV2降低宿主的免疫力的途径很多，但主要为两个方面：一方面，PCV2通过感染树突细胞（DC）与其相互作用，利用DC的吞噬作用，使其变成PCV2的储存和运输的媒介，然后通过释放某种介质，干扰免疫淋巴细胞正常增殖，从而降低宿主的免疫能力[12]。另一方面，PCV2的ORF3编码的非结构蛋白，可以通过级联反应分别激活 caspase-8和caspase-3,诱发感染组织细胞凋亡引发相应组织器官发生功能性障碍。当机体受到不良环境刺激时则可引起动物机体发病[13]。又由于感染PCV2的猪群免疫低下，在饲养环境改变和长途运输等应激条件下更容易感染其他疾病，从而诱发混合感染[14]。

3　PCV2的血清学方法

3.1酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是在检测PCV2方法中，使用最广的血清学方法，并且竞争ELISA、间接ELISA和抗原捕获ELISA都适用于PCV2的检测。Nawagitgul等[15]建立了以细胞培养的PCV2全病毒作为抗原（PCV2-ELI-SA）和以ORF2重组杆状病毒表达产物作为包被抗原（ORF2-ELISA）检测PCV2全病毒抗体的间接ELISA，并且这种方法在实验室已经被普遍使用。Walker等[16]利用PCV1和PCV2特异性单克隆抗体建立了竞争ELISA，并对来自英法等国家的484份感染PCV2的猪血清进行检测，实验结果表明：采用该方法病毒抗体检出率达到99%以上。Mc-Nei l ly等[17]以PCV2特异性单抗为工具建立了的抗原捕获ELISA也能够准确检测PCV2。ELISA具有较高的敏感性和特异性，并且能够一次性检测大量血清样品，因此非常适合血清学的大规模检测调查。

3.2间接免疫荧光试验（IFA）IFA，主要用于PCV分离效果鉴定及病变组织或猪源细胞 PCV2感染情况的检测。芦银华等[18]利用IFA检测法国内几个地区的规模化猪场，进行血清调查，结果表明，PCV2阳性率达到59%，说明了我国猪群中广泛流行PCV。同样，陈庆新等[19]利用IFA对浙江杭州地区的28个猪场采集的1 677血清进行PCV2检测，试验结果表明，PCV2阳性率为55.48%，表明杭州地区大范围感染PCV2.IFA具有成本低、准确和快速的特性，但因其操作复杂，所以很少能够应用于现场临床诊断。

3.3免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）IPMA方法具有操作简便、特异性和敏感度高等特点，是进行PCV2流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段。黄立平等[20]用IPMA对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测，PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%，PCV1抗体阳性猪中有95.9%为 PCV2阳性，表明我国猪群已存在PCV2感染，并且在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在。IPMA在检测PCV2方面的应用已经非常成熟，刘长明等[21]通过对IPMA反应条件的优化，研制了一种新型的PVC2的诊断试剂盒，研究结果表明该试剂盒具有实用、高效和特异等特点。

3.4免疫组织化学技术（IHC）IHC可以对携带PCV2的细胞及组织的形态进行大体的评价，而且在普通显微镜下就可以进行观察，是一种免疫染色法。唐宁等[22]利用IHC对PCV2人工感染猪进行全身监测，试验结果表明PCV2抗原阳性信号出现在淋巴组织（淋巴结、脾、扁桃体）、心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、大脑及小脑内。IHC具有定位准确、特异性强、操作简单等特点，并且对试验条件要求不高，检测成本低，因此是许多实验室首选的检测手段。

4　PCV2的分子生物学方法

4.1核酸原位杂交技术（ISH）ISH应用于检测组织切片中的DNA病毒，刘雯等[23]利用PCR地高辛探针合成的方法制备了长度为494 dp的特异性探针，并利用该探针建立了原位杂交组织切片检测方法，应用该方法检测PCV2感染猪的扁桃体和淋巴结组织，结果表明阳性信号主要存在于巨噬细胞胞浆中。Hamberg等[24]将IHC和ISH现结合建立一种检测技术，可以区别组织切片中正在复制过程中的PCV2和非复制状态的 PCV2。ISH具有特异性和敏感性，能够准确反应PCV2在组织细胞中的状态和分布，是为研究PCV2致病机理提供了有效的技术手段。

4.2聚合酶链反应技术（PCR）PCR是一种应用非常广泛的分子生物学技术，其在医学、食品学和遗传育种学等研究方面被广泛使用，而且随着不断地探索，研究者们建立了多种PCR方法来提高其使用效率。在检测PCV2方面，经常使用的PCR包括多重PCR、荧光定量PCR和RFLP-PCR。

4.2.1多重PCR多重PCR是指在一个PCR反应体系中，加入多种引物，扩增出多种DNA片段的技术，PCV常与其他病原混合感染引起严重症状，多重PCR可以一次性扩增出多种病原DNA片段，从而节省了对PCV与多种病原检测的时间，为临床诊断和防疫提供了帮助。王娟萍等[25]利用4对特异性引物，建立了PRRSV、PPV、PRV、PCV-2的四重PCR检测方法，以及相互间的任意二重PCR和三重PCR检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验，试验结果表明，建立的多重PCR的方法，具有较高的特异性和敏感性，可以同时准确检测出PRRSV、PPV、PRV、PCV-2四种病毒。

4.2.2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR是一种定量分析的试验技术，其简化了定量检测的过程，真正实现了绝对定量，其经常被应用于许多难培养的病毒检测诊断中，同时，也可以应用于潜伏期的病毒诊断。吴晓燕等[26]建立了针对PCV2 ORF2基因的SYBR GREENⅠ荧光定量PCR方法，并证明了该技术与与常规PCR相比提高了100倍的敏感性。实时荧光定量PCR与传统PCR相比具有较高的敏感性和特异性，能够实时监测反应过程，缩短了PCV2临床诊断的时间，同时为猪圆环病毒致病机理的研究提供了帮助。

4.2.3限制片段长度多态性聚合酶链反应（PFLP-PCR）PFLP-PCR是通过PCR扩增目的基因序列片段，然后用限制性内切酶酶切，再通过凝胶电泳呈现不同的条带，从而检测PCV2病毒，并且通过酶切片段的差异从而鉴定不同的基因型。王新等[27]根据GenBank中PCV全基因序列设计引物，建立了PCV2的PCR-RFLP检测方法，通过对PK-15细胞、IBRS-2细胞、PMWS和PDNS疑似病料进行了PCV检测及血清型的鉴定，结果表明，1个IBRS2细胞和1个PMWS病料检测出PCV1的基因片段，1个PMWS病料和1个PDNS病料检测出PCV2基因片段，从而证明PFLP-PCR方法可以用于PCV2的检测，并且能够快速、准确鉴别诊断出是PCV1或/和PCV2的感染。

5　结语

PCV2极易被感染，其所引发的猪圆环病毒病（PCVDs）在世界范围内广泛流行，且致死率极高，给养猪业造成了巨大经济损失，因此能够及早发现并及时采取防控措施是减少损失的保证，但是针对PCV2的实验室检测方法虽然有很多种，可是受到成本和条件的影响，很多快速准确的检测方法无法被广泛使用。因此一种成本低廉操作简便而快速准确的检测方法，不仅可以为养猪企业减少了经济损失，而且为猪病的疫情防控工作提供了有力的支撑，为养猪业的健康发展提供了保障。

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Reserch Progress on Detection Method of Porcine Circovirous Type2

Song Dahe1,Sun Xiaofei2,Jia Yun3,Sun Yan3
(1.Dal ian Airpor t Ent ry-Exit Inspection and Qurantine Bureau,LiaoningDal ian116001; 2.Liaoning Ent ry-Exit Inspection and Qurantine Bureau,LiaoningDal ian116001 3.Dal ian Forest Zoo,LiaoningDalian116000)

The cl inical features and pathological injuries of porcine circovirus diseases are simi lar to other swine diseases.It is very dif f icul t to make the cor rect diagnosis according to clinlcal symptom,therefore,the detection resul t of PVC2 become the important basis to diagnosis PCVDS.this paper summarizes and compares the detection technology of PVC2 including serological and molecular biological detection technology,what are usual ly used in the lab.

Porcine Circovirous Type2;Detection technology;Serology;Molecular biology

S858.28

A

1672-9692(2016)04-0054-04

2016-02-11

宋大贺（1984-），男，硕士研究生，兽医师，主要从事动植物检疫工作。