FSH及Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的增殖及雌激素分泌的影响

赵妙妙，姜晓龙，陈建伟，黄　洋，姚晓磊，曹　霞，李鹏飞，吕丽华*

(1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2.山西农业大学生命科学学院，太谷 030801)



FSH及Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的增殖及雌激素分泌的影响

赵妙妙1，姜晓龙1，陈建伟1，黄洋1，姚晓磊1，曹霞1，李鹏飞2，吕丽华1*

(1.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2.山西农业大学生命科学学院，太谷 030801)

摘要：旨在研究Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及雌激素分泌的影响，探究其是否与促卵泡素(Follicular stimulating hormone，FSH)有关。在添加有FSH以及不同浓度Wnt信号通路抑制剂IWR-1的培养基中培养绵羊卵巢卵泡颗粒细胞168 h，利用Guava ViaCount®Reagent测定细胞数目的变化，利用绵羊ELISA试剂盒检测雌激素浓度的变化，利用qRT-PCR检测FSH靶基因CYP19和CCND2的相对表达量差异。结果表明，无论有无FSH，抑制剂IWR-1使颗粒细胞数目显著减少(P<0.05)；当有FSH时，抑制剂IWR-1的添加导致雌激素浓度显著降低(P<0.05)。IWR-1的浓度为1.0 μmol·L-1时，对颗粒细胞的抑制效果最明显。IWR-1还导致CYP19和CCND2 mRNA的表达量降低。综上表明，Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的生物学功能具有促进作用，并且这种促进作用可能与FSH有关。

关键词：绵羊；卵泡颗粒细胞；Wnt信号通路；IWR-1；细胞培养

1982年R.Nusse等[1]在研究小鼠乳腺癌时首次发现了Wnt基因。Wnt信号通路可调控多种发生过程如细胞程序性死亡、增殖、分化和凋亡等[2]。Wnt家族的成员主要有3条不同的信号通路[3-7]：(l)经典的Wnt/β-catenin(CTNNB1)信号通路，可调节核内目的基因的表达；(2)平面的细胞极性通路(Planar cell polarity pathway)，参与组织极性调节、细胞迁移以及细胞骨架的重排；(3)Wnt/Ca2+通路，能刺激细胞内Ca2+的释放，并且对经典Wnt信号通路有一定阻碍作用。当细胞未受到刺激时，轴蛋白(AXIN2)结合到CTNNB1/糖原合酶激酶(CSK3)/结肠癌抑制因子(APC)复合体当中，导致CTNNB1迅速降解，信号传导通路关闭；而当Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt配体与受体卷曲蛋白(Frizzled，FZD)以及LDL受体相关蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)结合形成三聚体，从而激活蓬乱蛋白(Dishevelled1，Dsh1/DVL1)，使DVL1与AXIN2相结合，导致AXIN2/CSK3/APC/CTNNB1的复合体被破坏，致使CTNNB1无法被降解，故CTNNB1可进入到细胞核内，并对基因的转录进行调控[8]。IWR-1是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂[9-10]，通过改变AXIN2对CTNNB1的结合力从而改变多蛋白复合体的稳定性，使CTNNB1被降解，最终起到抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的作用[11]。

哺乳动物中Wnt/β-catenin信号通路的研究最初局限于人和鼠，S.Vainio等[12]发现：Wnt/β-catenin信号通路对胚胎期小鼠卵巢发育上具有重要作用。D.Boerboom等[13]研究表明：Wnt/β-catenin信号通路的错误调控将引发卵巢颗粒细胞肿瘤。可见，Wnt/β-catenin信号通路对哺乳动物卵巢及卵巢颗粒细胞具有一定的作用。FSH作为一种重要的促性腺激素，与卵巢颗粒细胞也存在密切联系，高庆华等[14]研究表明：FSH能诱导颗粒细胞增殖及提高其雌激素合成能力，颗粒细胞雌激素的合成能力与生理浓度的FSH存在剂量依赖关系。P.S.Gupta等[11]研究发现：Wnt信号通路可增强FSH在牛优势卵泡选择中的活动。因此，在哺乳动物的繁殖调控过程中，Wnt/β-catenin信号通路与FSH之间可能存在一些影响。

本研究在有或无最适浓度FSH以及不同浓度Wnt信号通路抑制剂IWR-1的培养基中体外培养绵羊卵泡颗粒细胞，观察其对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及雌激素分泌的影响。明确Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的作用，为进一步研究Wnt信号通路的功能奠定基础。

1材料与方法

1.1材料及主要试剂

本试验选用山西省晋中市清徐县绵羊屠宰场性成熟绵羊的健康卵巢。

MEMα基础培养液、非必需氨基酸(NEAA)、促卵泡素(FSH)、两性霉素B(Invitrogen，美国)、DMSO、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、转铁蛋白、牛血清蛋白(BSA)、亚硒酸钠(Na2SeO3)、雄激素、碳酸氢钠(NaHCO3)、胰蛋白酶(Sigma，美国)、台盼蓝、氨苄青霉素、链霉素(上海生物工程公司)、IWR-1(上海蓝木化工有限公司)、Guava ViaCount®Reagent(Millipore，美国)、Sheep Estradiol Elisa(上海蓝基生物科技有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养

1.2.1.1绵羊卵泡颗粒细胞的收集：将采集的健康卵巢快速带回实验室，认真分离并选取大小适中(3 mm<卵泡直径<5 mm)的卵泡，用无菌的杜氏磷酸缓冲液(DPBS)漂洗两次。在超净台内，剪开卵泡并放入盛有培养液的小表面皿中，用刮刀轻轻刮动卵泡内壁。收集带有颗粒细胞的培养液，500 r·min-1离心后弃底部杂质，然后1 400 r·min-1离心，弃上清，加入培养液重悬细胞。

1.2.1.2活细胞密度检测：取少量颗粒细胞悬液与等体积0.4%的台盼蓝混合，染色1 min，利用血细胞计数板在显微镜下观察并计算活细胞浓度，算出每个培养孔中的细胞数目。

1.2.1.3颗粒细胞的培养：根据上述计算结果稀释细胞悬液，并将其接种到96孔细胞培养板内，每孔的活细胞数约为2万个。细胞被分为A、B两大组进行培养，1组未添加FSH(添加与FSH等量的培养液)，第2组添加最适浓度(5 ng·mL-1)的FSH[24]。每组内再继续分为对照组(A1/B1)以及添加不同浓度(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)的Wnt信号通路抑制剂IWR-1的试验组(A2、A3、A4/B2、B3、B4)。每个浓度的培养孔做3个重复。

1.2.1.4细胞液的收集：细胞培养168 h后，将细胞上清液移入无菌EP管内，-20 ℃储存，测雌激素浓度备用。

1.2.1.5细胞活率检测：向细胞培养孔中加入37 ℃的胰酶100 μL消化处理5～10 min，然后加入100 μL 10% FBS终止消化。移出细胞悬液50 μL，并加入Guava ViaCount· Reagent工作液450 μL，静置10 min(避光)，用流式细胞仪进行活率检测。收集其余细胞悬液，-80 ℃储存。

1.2.1.6雌激素测定[15]：雌激素的测定是利用绵羊ELISA试剂盒，按照说明书进行正规操作，最后利用酶标仪读取OD值，并计算雌激素浓度。

1.2.2FSH靶基因表达量检测

1.2.2.1总RNA的提取：将1.2.1.5 -80 ℃储存的悬液从冰箱取出，用Trizol法提取总RNA[16]。

1.2.2.2cDNA合成：按照PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明，加入1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，2 μL RNA，RNase Free定容到10 μL。反应条件为42 ℃ 2 min，4 ℃ 5 min。加入1 μL RT Primer Mix，4 μL 5×PrimeScript®Buffer 2，1 μL PrimeScript®RT Enzyme Mix I，RNase Free定容到20 μL。反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。反应结束后，检测产物纯度及浓度，于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2.3引物设计与合成：根据NCBI上绵羊的预测序列，利用Primer 3和Oligo 6软件设计目的基因的引物；以绵羊β-Actin基因作为内参基因，引物序列见表1。

表1荧光定量PCR引物序列

Table 1Primers sequence of quantitative PCR

1.2.2.4qRT-PCR反应：以之前细胞培养试验中的A1、A3、B1、B3的cDNA为模板，构建20 μL qRT-PCR 反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μL， Rox Reference Dye(50×)0.4 μL，PCR 上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6 μL，反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，45个循环。扩增完成后软件自动生成扩增曲线、熔解曲线，利用其CT值分析结果。

1.3统计分析

试验数据用SPSS(Statistic Package for Social Science 18.0)进行分析，采用单因素方差分析和显著性检验的方法。qRT-PCR 相对表达量结果用“平均值±标准差(Means±SD)”表示，采用△△CT的计算方法，相对表达量= 2-△△CT。各基因表达量均经内参β-Actin校正。

2结果

2.1FSH和IWR-1处理体外培养绵羊卵泡颗粒细胞168 h后生长状况

由图1可见，在A、B组中，对照组(A1/B1)与试验组(A2、A3、A4/B2、B3、B4)相比，生长状况相对较好，细胞数目较多，聚团现象明显；长势最佳的是添加有FSH但无IWR-1的(B1)组，细胞数目最多，聚团最明显。可见，在体外培养的条件下，FSH可促进颗粒细胞的生长，而Wnt信号通路抑制剂IWR-1可抑制颗粒细胞的生长。

2.2FSH和IWR-1处理体外培养绵羊卵泡颗粒细胞168 h后细胞数目的变化

由图2可以看出，当培养基中无IWR-1但添加有最适浓度5 ng·mL-1的FSH时，颗粒细胞数目最多，显著高于其他组别(P<0.05)；无论是否有外源FSH存在，IWR-1的添加使颗粒细胞数目下降，但是当IWR-1浓度到达一定浓度后，细胞数目反而有所上升。未添加FSH的试验组中，IWR-1浓度为0.1和1.0 μmol·L-1时细胞数目最少；添加有FSH的试验组中，IWR-1浓度为1.0 μmol·L-1时，细胞数目显著少于其他组(P<0.05)。FSH可以促进颗粒细胞的增殖，而IWR-1可以抑制颗粒细胞的增殖。

2.3FSH和IWR-1处理体外培养绵羊卵泡颗粒细胞168 h后雌二醇浓度变化

由图3可看出，当培养基中只添加有5 ng·mL-1的FSH时，雌激素浓度最大，显著高于其他组(P<0.05)；无FSH的试验组中，IWR-1的添加对雌激素的分泌无显著影响，有FSH的试验组中，IWR-1的添加使雌激素浓度降低，当IWR-1浓度为0.1和1.0 μmol·L-1时，雌激素浓度显著小于其他组(P<0.05)。结果表明，FSH可促进颗粒细胞雌激素的分泌，IWR-1可以抑制颗粒细胞雌激素的分泌，且IWR-1的抑制作用可能与FSH 有关。

2.4FSH和IWR-1处理体外培养绵羊卵泡颗粒细胞168 h后FSH靶基因的表达差异

由图4可看出，在培养基中添加最适浓度的FSH，促使基因CYP19和CCND2表达量升高，而IWR-1的作用又会降低CYP19 mRNA和CCND2 mRNA的表达量。表明，IWR-1可降低FSH对颗粒细胞的促进作用。

3讨论

FSH是一种重要的促性腺激素，可调控哺乳动物卵泡的发生；能够结合颗粒细胞中的FSH受体，激活cAMP通路，从而调节芳香化酶的活性[17]，进而促使哺乳动物卵泡颗粒细胞的数目增多，颗粒细胞的雌激素浓度增大[18-22]。颗粒细胞的增殖以及雌激素的合成都与体外添加的FSH浓度有关[23]。李鹏飞等[24]研究绵羊卵泡颗粒细胞时发现，当FSH浓度为5 ng·mL-1时，细胞生长状态最佳。

有研究证实，Wnt信号通路对卵巢中类固醇生成有重要的调控作用[25]。本试验探究Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的调控是通过使用通路抑制剂IWR-1来研究的。抑制剂IWR-1可破坏细胞质AXIN2依赖的复合物的稳定性，从而阻碍对CTNNB1的降解作用，最终阻碍Wnt/β-catenin信号通路[9-11]。

本研究表明，FSH促进绵羊卵泡颗粒细胞的生长，当培养液中添加最适浓度(5 ng·mL-1)的FSH时，颗粒细胞数目明显增多，细胞聚团现象明显，雌激素浓度增大。Wnt信号通路抑制剂IWR-1的作用可抑制颗粒细胞生长，当IWR-1浓度为0.1、1.0 和10.0 μmol·L-1时，对颗粒细胞均有抑制效果，但1.0 μmol·L-1的IWR-1抑制效果最明显，颗粒细胞数目最少，聚集生长的细胞团最少，雌激素分泌量最少，因此1.0 μmol·L-1为抑制效果最强的抑制剂IWR-1浓度。此外，当培养基中未添加FSH时，抑制剂浓度为0.1与1.0 μmol·L-1的试验组之间以及对照组与10.0 μmol·L-1的试验组之间，颗粒细胞的增殖数目无显著差异，同样，在无FSH时，雌激素的浓度在对照组与0.1、1.0 μmol·L-1的抑制剂组之间均无显著差异。然而当培养基中添加最适浓度的FSH时，无论是颗粒细胞的增值数目还是雌激素浓度，在各试验组之间均出现显著差异。表明，FSH增强了IWR-1对颗粒细胞的抑制效果。

CYP19基因可以编码芳香化酶，当雌激素合成时能够催化雄激素向雌激素的转化，在雌激素的合成过程中起重要的调控作用[26-27]。CCND2基因可以调节颗粒细胞的增殖[28]。有研究表明，CYP19和CCND2都是FSH的靶基因，FSH的作用会使细胞内CYP19和CCND2 mRNA的表达量增加[29]。本试验发现，Wnt信号通路抑制剂IWR-1降低了细胞内由于FSH诱导的CYP19 mRNA的增加量，而对于CCND2 mRNA也同样表现出相似的结果。这与P.S.Gupta等[11]的研究结果：Wnt信号通路可以增强FSH在牛优势卵泡选择中的活动，具有一定程度上的一致性。

4结论

Wnt信号通路可以促进绵羊卵泡颗粒细胞的增殖和雌激素的分泌。不同浓度的Wnt信号通路抑制剂IWR-1对绵羊卵泡颗粒细胞增殖和雌激素分泌存在不同的抑制效果，当IWR-1的浓度为1.0 μmol·L-1时，抑制效果最明显。此外，Wnt信号通路还可以调节FSH在颗粒细胞中的作用，综上表明，Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的影响，可能是通过调节FSH的作用来发挥的。

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(编辑程金华)

Effects of FSH and Wnt Signaling Pathway on Proliferation and Estrogen Secretion of Sheep Granulosa Cells

ZHAO Miao-miao1，JIANG Xiao-long1，CHEN Jian-wei1，HUANG Yang1，YAO Xiao-lei1，CAO Xia1，LI Peng-fei2，LÜ Li-hua1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Key words:sheep；granulosa cells；Wnt signaling pathway；IWR-1；cell culture

Abstract:This study aims to investigate the effect of Wnt signaling pathway on proliferation and estrogen secretion of sheep granulosa cells and to explore whether the effect was related to FSH(Follicular stimulating hormone，FSH).With or without FSH，sheep granulosa cells were cultured in medium with different concentrations of Wnt signaling pathway inhibitor IWR-1 for 168 h.Then，Guava ViaCount®Reagent was used to detect the changes of cell number and sheep ELISA kit was used to detect the changes of estrogen concentrations.The relative expression ofCYP19 andCCND2，which are the target genes of FSH，was analyzed by qRT-PCR.The results showed that IWR-1 could cause a significant(P<0.05) reduction in the number of granule cells whether FSH existed or not.With the presence of FSH，the addition of IWR-1 could significantly(P<0.05) decrease estrogen concentration.When the concentration of IWR-1 was 1.0 μmol·L-1，its inhibitory effect on granulosa cells was of most obvious.Besides，IWR-1 decreased the abundance ofCYP19 mRNA andCCND2 mRNA.In conclusion，Wnt signaling pathway can improve the biological function of sheep granulosa cells，and this function may be related to FSH.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.009

收稿日期：2015-05-06

基金项目：国家自然科学基金(31172211)；山西省回国留学人员科研资助项目(2014-重点5)；山西农业大学科研管理费资助重大项目和标志性成果培育项目(71060003)

作者简介：赵妙妙(1989-)，女，山西大同人，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：1203418618@qq.com *通信作者：吕丽华，E-mail：sxaullh@yahoo.com.cn

中图分类号：S826.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0064-07