周细胞凋亡与糖尿病性视网膜病变的研究进展

唐敏综述，吕红彬审校

（西南医科大学附属医院眼科，四川泸州646000）

周细胞凋亡与糖尿病性视网膜病变的研究进展

唐敏综述，吕红彬审校

（西南医科大学附属医院眼科，四川泸州646000）

糖尿病性视网膜病变；周细胞凋亡；研究进展

据调查，至2010年，我国18岁以上成年人罹患糖尿病（diabetes mellitus,DM）的人数约有超过1.1亿，患病率高达11.6%，是糖尿病患病人数最多的国家[1]，西方国家的DM患病率也呈逐年上升趋势。糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是随着DM病程延长而逐渐出现的糖尿病性微血管病变，为DM的严重并发症之一，发展至增殖期可致盲[2]。DR的早期病理改变主要为：视网膜毛细血管周细胞（Peripheral cell,PC）减少或消失、影周细胞形成及无细胞毛细血管出现、内皮细胞增生、基底膜增厚及血-视网膜屏障破坏等，继而导致视网膜血管管腔狭窄、血流动力学改变，最终导致视网膜毛细血管闭塞，促进DR后期视网膜缺血、缺氧以及新生血管形成[3-4]。视网膜毛细血管周细胞丢失为DR最早期病理改变之一，在DR的发生发展中起着至关重要的作用，然而，对视网膜周细胞凋亡的机制仍不十分清楚，多年来众多学者致力于对周细胞凋亡机制的研究，本文就糖尿病视网膜病变早期周细胞凋亡的相关信号通路及细胞因子作一综述，期望为糖尿病视网膜病变中周细胞凋亡的进一步研究提供新的思路。

1 周细胞与糖尿病视网膜病变概述

周细胞在调节微血管生理及病理性血管生成过程中起着举足轻重的作用[5-6]。在微血管系统中，周细胞和毛细血管内皮细胞由共同的基底膜包绕，两者通过物理接触及旁分泌信号进行细胞通讯，共同调节血管形成、病理性血管新生、血管渗漏、肿瘤形成等病理生理过程。毛细血管形成早期，周细胞的募集可促使新生毛细血管的发生和发展；而血管形成后期，周细胞则抑制内皮细胞增生，促进内皮细胞分化，从而促进血管成熟，维持正常结构和调节其通透性。在慢性高血糖的刺激下，视网膜毛细血管最早出现周细胞的丢失，进而出现了影周细胞及无细胞毛细血管[7]，推测早期毛细血管周细胞凋亡可能是诱导病理性血管生成的前提。

2 糖尿病性视网膜病变周细胞凋亡相关信号通路及细胞因子

2.1 STAT1信号通路介导的Bim蛋白表达与视网膜周细胞凋亡

Bim蛋白属于Bcl-2（B cell lymphoma-2）家族促凋亡成员之一。Bcl-2家族成员通过复杂的相互作用在细胞层面调控生物的生存和死亡信号，该家族可分为三大类：Bcl-2样生存因子，Bax样死亡因子，以及BH3-only死亡因子如Bim、Bik、Puma、Bid等。BH3-only死亡因子又被称为BH3-only蛋白，其得名源于它只含有一个BH3域。BH3-only蛋白可通过翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化、泛素化等）和蛋白水解等方式激活，而Bim蛋白可与某些大分子结合来保持其失活状态。Bcl-2蛋白家族可通过维持线粒体稳态来调控细胞凋亡，并且这种调控作用依赖于抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡[8]。

ES Shin等[9]研究发现，糖尿病大鼠视网膜周细胞和高糖条件下培养的大鼠视网膜周细胞中促凋亡蛋白Bim表达增多，并阐明视网膜周细胞中Bim表达增多依赖于持续活化的信号转导与转录激活因子1（signal transducers and activators of transcriptions,STAT1）。Jenny等[10]也认为，Bim促凋亡蛋白的表达受STAT1转录调控，而STAT1受炎症因子特别是干扰素家族如IFN-α、IFN-β、IFN-γ及IL-1β等激活[11-12]。STAT1最早是在研究IFN信号通路时被发现的一种蛋白，不同的IFN亚族激活STAT1形式不完全一致：IFN-α、IFN-β刺激可形成STAT1同型二聚体进而启动GAS驱动的基因转录，而IFN-γ诱导STAT1同型二聚体和STAT1/STAT2异型二聚体形成，后者可启动ISRE驱动的基因转录[13-14]。糖尿病患者血清中IFN-γ等明显增加，最新研究表明，干扰素家族可通过激活JAK-STAT1信号途径而使STAT1磷酸化，激活的STAT1蛋白从胞膜进入胞核而启动基因转录[15]。ES Shin[9]等通过测量不同浓度葡萄糖培养下的视网膜周细胞中活化的STAT1及STAT1总量，发现高糖条件下培养的视网膜周细胞中STAT1磷酸化水平明显提高，STAT1可能通过以上途径上调Bim蛋白表达，进而调控视网膜周细胞凋亡。

2.2 氧化应激与周细胞凋亡

目前的研究结果显示，氧化应激（oxidative stress,OS）在DR的发生和发展过程中起了非常重要的作用[16]。线粒体呼吸链是体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要来源，高糖所致的代谢异常可诱导线粒体电子运输链（mitochondrial,electron transport chain，ETC）产生过多的ROS，一定浓度的ROS是维持机体基本生理过程必须的，而过量的ROS可对机体微环境产生破坏性的损伤。氧化还原反应贯穿于细胞生存、活动的整个过程，活性氧增加导致视网膜代谢异常，而这些异常的代谢又能产生活性氧，由此构成恶性循环，持续暴露于高活性氧坏境下最终导致线粒体DNA损伤，细胞死亡[17]。最新研究显示，ROS可介导多个生物途径参与糖尿病性微血管并发症，包括活化核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体，激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路，以及SIRT1/ROS信号途径活化[18-20]等。此外，多元醇途径及细胞内糖基化终末产物的增加、蛋白激酶C的激活以及己糖胺途径的增加等已成为研究相对成熟的途径[21-22]，各信号途径之间的相互联系仍需进一步详细阐明。研究显示，高糖诱导的牛视网膜毛细血管周细胞（BRPs）线粒体产生过多ROS，提示氧化应激是诱导周细胞凋亡的主要原因之一[23-25]。

最近研究发现，ROS在体内可作为一种信号分子通过多种途径激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路而诱导细胞损伤、自噬和凋亡[26]。ROS-JNK信号通路对细胞生存状态的调控高度依赖胞内ROS水平，适宜水平的ROS可短暂激活JNK通路，从而引起细胞自噬而不足以引起细胞凋亡，但过量的ROS引起JNK通路持续活化，经线粒体途径引起细胞凋亡[27]。

2.3 多元醇通路与周细胞凋亡

持续高血糖刺激可激活由醛糖还原酶（aldose reductase，AR）和山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）共同参与的葡萄糖多元醇通路，AR是此过程的限速酶。高糖刺激下，醛糖还原酶活性增加，过量的葡萄糖不能经己糖激酶催化形成6-磷酸葡萄糖，而是在AR的催化下以还原型辅酶Ⅱ（NADPH）为辅酶被还原为山梨醇，山梨醇在SDH作用下被氧化为果糖，其辅酶为氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）。目前研究认为，此途径的致病机制如下：山梨醇及果糖代谢缓慢且不易通过细胞膜弥散，因而导致对微血管的渗透压损伤；山梨醇的激活同时抑制磷酸己糖旁路，引起细胞内肌醇减少，导致Na+-K+-ATP酶活性下降，DNA活性下降及细胞死亡；山梨醇在氧化过程中胞浆中NADP/NAD+比值增加，抑制了3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的活性，磷酸丙糖浓度增加，从而使甲基丙二醛和二酰甘油的形成增加，后两者是一种糖基化终末产物（AGEs）的前体，从而可激活蛋白激酶C途径而导致细胞损伤[28-29]。

Akagi Y等[30-31]通过免疫组化研究发现，经胰蛋白酶消化分离的人和狗视网膜周细胞中AR表达量十分丰富，而醛糖还原酶抑制剂（aldose reductase Inhibitors,ARI）可明显减少高糖介导的周细胞凋亡[32-33]。新近研究表明，高糖条件下培养的牛视网膜周细胞中钙离子浓度和caspase-3活性显著增加，而还原型谷胱甘肽含量（GSH）含量明显降低，周细胞活性降低，而加入醛糖还原酶抑制剂SNK-860后以上异常明显被抑制[34]，这表明AR催化的多元醇通路在高糖诱导的周细胞凋亡中起着重要的作用。

2.4 硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）表达与周细胞凋亡

硫氧还蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin Interacting Protein,TXNIP）又称硫氧还蛋白结合蛋白-2（TBP-2）或维生素D3上调蛋白1（VDUP-1），可通过抑制硫氧还蛋白（Thioredoxin，TRX）系统发挥介导氧化应激、诱导细胞凋亡、对抗细胞增殖等作用而被称为促氧化应激/促凋亡蛋白[35]。Devi T S等[36]研究发现，TXNIP在实验性糖尿病大鼠视网膜中表达上调并介导炎症反应和细胞凋亡。不同浓度葡萄糖环境下培养实验性大鼠视网膜周细胞，并予以抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸（NAC）及TXNIP抑制剂Azas或siTXNIP3干预对比，结果表明，高糖环境下视网膜周细胞TXNIP表达增加，并与ROS产生、蛋白质巯基亚硝基化及促凋亡蛋白caspase-3表达量呈正相关，提示TXNIP与视网膜周细胞凋亡密切相关。

最新研究表明，TXNIP与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）在糖尿病微血管病变包括糖尿病视网膜病变中发挥重要作用[37]。其机制可能为：持续高血糖代谢诱导产生大量活性氧族，可作为共同刺激信号激活NLRP3炎症小体，TXNIP与TRX解离后随之结合NLRP3进而激活炎症小体，形成正反馈效应，其直接效应是裂解caspase-1，活化IL-1β，并促进其他炎症反应因子释放，从而介导糖尿病性视网膜细胞损伤[38]，但是TXNIP与NLRP3是否在视网膜周细胞中产生同样的作用而促进周细胞凋亡有待进一步研究。

2.5 促凋亡转录因子FoxO1与周细胞凋亡

FoxO1转录因子属于叉形头转录因子的O亚型，是Fox（forkhead transcription factors of the O class）家族中的一员，此类转录因子的特点是具有鲜明的叉头DNA结合域，目前已发现FoxO1、FoxO3a、FoxO4、FoxO6等至少4个FoxO亚族成员，其中FoxO1基因定位于人染色体13q14.1，可编码655个氨基酸[39]。FoxO1转录因子通过转录和传导各种生长因子及细胞因子来调节细胞氧化应激、增殖、凋亡和炎症等多种病理生理过程。FoxO1是PI3K/AKT信号通路的直接下游分子，PI3K/AKT信号通路激活可使其发生磷酸化，FoxO1从细胞核转移至细胞质，其转录活性降低，从而抑制其调控的下游基因表达，抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路使Fox-O1转录因子活性增强，促进细胞凋亡[40]。Alikhani M[41]等认为，高糖刺激下FoxO1转录因子的活化可能通过丝裂原活化蛋白（MAP）激酶途径激活。丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一系列丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化其他细胞质蛋白，并从胞浆转移至胞核而调节转录因子活性，目前已发现4个MAPK亚族，其中p38（SAPK2，PK，CSBP或Mxi2）和JNK（c-Jun氨基末端激酶）在大多数细胞中产生促凋亡信号，而即细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）产生典型的抗凋亡信号[42-43]。Mani A等[44]通过体外实验表明，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或CML（羟甲基赖氨酸，一种糖基化终末产物）刺激下的视网膜周细胞中的FoxO1DNA结合活性明显增强，周细胞活性显著降低，并且siRNA干扰技术抑制FoxO1表达可明显抑制周细胞凋亡，提示FoxO1在视网膜周细胞凋亡中发挥重要作用。

3 小结与展望

视网膜毛细血管壁由内皮细胞和周细胞两种细胞组成，周细胞紧靠内皮细胞，由共同的基底膜包绕。周细胞和内皮细胞在结构和功能上都联系紧密，它们之间通过物理接触及旁分泌信号进行通讯，共同调节血管形成、病理性血管新生、血管渗漏、肿瘤形成等病理生理过程。毛细血管形成早期，周细胞的募集可促使新生毛细血管的发生和发展；血管形成后期，周细胞则抑制内皮细胞增生，促进内皮细胞分化，从而促进血管成熟，早期周细胞的丢失可能是启动内皮细胞增殖及触发新生血管生成的“调控开关”[45]。研究表明，在糖尿病视网膜病变早期病理改变即出现周细胞丢失，继而出现内皮细胞增殖、基底膜增厚、血-视网膜屏障破坏等病理变化，最终发展为增殖型糖尿病性视网膜病变。因此，作为糖尿病视网膜病变发生发展的早期事件，周细胞凋亡相关研究成为热点。综上所述，持续高糖刺激下视网膜周细胞凋亡与氧化应激、多元醇通路激活、促凋亡相关因子激活等多因素相关，但是目前的大多数研究仍局限于体外实验，且细胞凋亡相关的信号途径及调控因子等在诸如病理性新生血管形成、肿瘤发生等过程中存在交互作用，因此，视网膜毛细血管周细胞凋亡与糖尿病视网膜病变的发生发展的确切机制仍有待进一步研究阐明，不断总结既往研究有助于为新的研究进展提供新的思路，最终阐明糖尿病视网膜病变的发病机制。

1.Wenying Y,Juming L,Jianping W,et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].New England Journal of Medicine,2010,362（12）:1 090-1 101.

2.Laatikainen L,Ojamo M,Rudanko S L,et al.Improving visual prognosis of the diabetic patients during the past 30years based on the data of theFinnish Register of Visual Impairment[J].Acta Ophthalmologica,2016.93（3）:226-231.

3.Cai X,Mcginnis J F.Diabetic Retinopathy:Animal Models,Therapies,and Perspectives[J].Journal of Diabetes Research,2016,2016（10）:1-9.

4.Hans-Peter H,Yuxi F,Frederick P,et al.Diabetic retinopathy:targeting vasoregression[J].Diabetes,2011,60（1）:9-16.

5.Chen Z,Xu X H,Hu J.Role of pericytes in angiogenesis: focus on cancer angiogenesis and anti-angiogenic therapy[J]. Neoplasma,2016.63（2）:173-182.

6.Orlova V V,Drabsch Y,Freund C,et al.Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts[J].Arteriosclerosis Thrombosis&Vascular Biology,2014,34（1）:177-186.

7.Barber A J,Gardner TW,Abcouwer SF.The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy[J].Investigative Ophthalmology&Visual Science,2011,52（2）:1 156-1 163.

8.Lomonosova E,Chinnadurai G.BH3-only proteins in apoptosis and beyond:an overview[J].Oncogene，2008, 27（Suppl 1）:S2-S19.

9.Shin ES,Huang Q,Gurel Z,et al.STAT1-mediated Bim expression promotes the apoptosis of retinal pericytes under high glucose conditions[J].Cell Death&Disease,2014,5（1）:986-986.

10.Jenny,Barthson,Carla M,Germano,Fabrice,Moore,ect. Cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ induce pancreatic β-cell apoptosis through STAT1-mediated Bim protein activation[J].Journal of Biological Chemistry,2011,286（45）:39 632-39 643.

11.Moore F,Santin I,Nogueira TC.et al.The transcription factor C/EBP delta has anti-apoptotic and anti-inflammatory roles in pancreatic beta cells[J].PLoS One,2012,7:（2）:268-270.

12.Barthson J,Germano CM,Moore F,et al.Cytokines tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma induce pancreatic beta-cell apoptosis through STAT1-mediated Bim protein activation[J].J Biol Chem,2011,286:39 632-39 643.

13.Katarzyna B?aszczyk,Olejnik A,Chmielewski S,et al.25: STAT2 and IRF9-dependent IFN-I signaling restores ISRE-mediated transcription and anti-viral activity independent of STAT1[J].Cytokine,2013,63（3）:248-249.

14.Overmeire E V,Laoui D,Keirsse J,et al.STAT of the union:Dynamics of distinct tumor-associated macrophage subsets governed by STAT1[J].European Journal of Immunology,2014,44（8）:2 238-2 242.

15.Dong G,Ming Y,Fan H,et al.STS-1 promotes IFN-α induced autophagy by activating the JAK1-STAT1 signaling pathway in B cells[J].European Journal of Immunology,2015,45（8）:2 377-2 388.

16.Shashi Sharma MD,Saxena S,Khushboo Srivastav MD,et al.Nitric oxide and oxidative stress is associated with severity of diabetic retinopathy and retinal structural alterations[J].Clinical&Experimental Ophthalmology,2015, 43（5）:429-436.

17.Kowluru RA,Mishra M.Oxidative stress,mitochondrial damage and diabetic retinopathy[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2015,1852（11）:2 474-2 483.

18.Huanqi S,Zhen Z,Xiaodan W,et al.Inhibition of autophagy induces IL-1β release from ARPE-19 cells via ROS mediated NLRP3 inflammasome activation under high glucose stress[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2015,463（4）:1 071-1 076.

19.Kovac S,Angelova PR,Holmström KM,et al.Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-General Subjects,2015,1850（4）:794-801.

20.Jiang Y,Sun Y,Yuan Y.Mechanism of Anti-glioblastoma Effect of Temzolomide Involved in ROS-Mediated SIRT1 Pathway[J].国际转化医学杂志（英文版）,2014（1）.

21.Brownlee M．The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism[J]．Diabetes,2005,54：1 615-1 625.

22.Giacco F，Brownlee M．Oxidative stress and diabetic complications[J]．Circ Res，2010,107：1 058-1 070.

23.Cui Y Xu X，Bi H，Zhu Q，et al．Expression modification of uncoupling proteins and MnSOD in retinal endothelial cells and pericytes induced by high Nucose：the role of reactive oxygen species in diabetic retinopathy[J]．Exp Eye Res,2006,83（4）：807-816.

24.Mustapha NM,Tarr JM,Kohner EM,et al.NADPH Oxidase versus Mitochondria-Derived ROS in Glucose-Induced Apoptosis of Pericytes in Early Diabetic Retinopathy[J].Journal of Ophthalmology,2010,2010（1）:85-92.

25.Amano S,Yamagishi S,Inagaki Y,et al.Pigment epithelium-derived factor inhibits oxidative stress-induced apoptosis and dysfunction of cultured retinal pericytes[J].Microvascular Research,2005,69（69）:45-55.

26.Scherz-Shouval R,Elazar Z.Regulation of autophagy by ROS:physiology and pathology[J].Trends in Biochemical Sciences,2011,36（1）:30-38.

27.Iman F,Heba AH,Narayana K.Resveratrol alleviates diabetes-induced testicular dysfunction by inhibiting oxidative stress and c-Jun N-terminal kinase signaling in rats[J]. Toxicology&Applied Pharmacology,2015,289（3）:482-494.

28.Lorenzi M.The polyol pathway as a mechanism for diabetic retinopathy:attractive,elusive,and resilient[J].Experimental Diabetes Research,2006,2007（1）:164-173.

29.Dagher Z,Park YV,Hoehn T,et al.Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy[J].Diabetes,2004,53（9）:2 404-2 411.

30.Akagi Y,Kador PF,Kuwabara T,et al.Aldose reductase localization in human retinal mural cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci.1983;24:1516-1519.

31.Akagi Y,Terubayashi H,Millen J,et al.Aldose reductase localization in dog retinal mural cells[J].Curr Eye Res, 1986,5:883-886.

32.Hohman TC,Nishimura C,Robison WG Jr.Aldose reductase and polyol in cultured pericytes of human retinal capillaries[J].Exp Eye Res,1989,48:55-60.

33.Naruse K,Nakamura J,Hamada Y,et al.Aldose reductase inhibition prevents glucose-induced apoptosis in cultured bovine retinal microvascular pericytes[J].Exp Eye Res,2000,71:309-315.

34.Miwa K,Nakamura J,Hamada Y,et al.The role of polyol pathway in glucose-induced apoptosis of cultured retinal pericytes[J].Diabetes Research&Clinical Practice, 2014,9（9）:104 396-104 396.

35.Singh LP.Thioredoxin Interacting Protein（TXNIP）and Pathogenesis of Diabetic Retinopathy[J].Journal of Clinical &Experimental Ophthalmology,2013,4（1）:30-42.

36.Devi TS,Ken-Ichi H,Tetsuya T,et al.Critical role of TXNIP in oxidative stress,DNA damage and retinal pericyte apoptosis under high glucose:implications for diabetic retinopathy[J].Experimental Cell Research,2013,319（7）: 1 001-1 012.

37.Li Y,Yang J,Chen MH,et al.Ilexgenin A inhibits endoplasmic reticulum stress and ameliorates endothelial dysfunction via suppression of TXNIP/NLRP3 inflammasome activation in an AMPK dependent manner[J].Pharmacological Research,2015,99:101-115.

38.Tseng WA,Thein T,Kinnunen K,et al.NLRP3 inflammasome activation in retinal pigment epithelial cells by lysosomal destabilization:implications for agerelated macular degeneration[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2013,54: 110-120.

39.Kaestner KH,Knochel W,Martinez DE.Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors [J].Genes&Development,2000,14（2）:142-146.

40.Roy SK,Srivastava RK,Shankar S.Inhibition of PI3K/ AKT and MAPK/ERK pathways causes activation of FOXO transcription factor,leading to cell cycle arrest and apoptosis in pancreatic cancer[J].Journal of Molecular Signaling,2014,5（1）:10.

41.Alikhani M,Maclellan CM,Raptis M,et al.Advanced glycation end products induce apoptosis in fibroblasts through activation of ROS,MAP kinases,and the FOXO1 transcription factor[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007, 292:850-856.

42.Johnson GL,Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK,JNK,and p38 protein kinases[J].Science,2002,298:1 911-1 912.

43.2 4.Kumar S,Boehm J,Lee JC.p38 MAP kinases:key signaling molecules as therapeutic targets for inflammatory diseases[J].Nat Rev Drug Discov,2003,2:717-726.

44.Mani A,Sayon R,Graves D T.FOXO1 plays an essential role in apoptosis of retinal pericytes[J].Molecular Vision, 2010,16:408-415.

45.Arboleda-Velasquez JF,Valdez CN,Marko CK,et al. From pathobiology to the targeting of pericytes for the treatment of diabetic retinopathy[J].Current Diabetes Reports,2015,15（2）:573-573.

（2016-04-27收稿）

R774.1+3

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.026

唐敏（1989-），女，硕士生。E-mail:470080275@qq.com