抑制miR181b通过上调PKG-1减轻大鼠心肌细胞肥大

杨军曹谦钟伟李倩金涛



抑制miR181b通过上调PKG-1减轻大鼠心肌细胞肥大

杨军①曹谦②钟伟①李倩①金涛①

【摘要】目的：通过检测miR181b在心肌肥厚患者外周血中的表达，研究miR181b与PRKG-1在心肌肥大中的作用机制，为心肌肥厚临床诊断和治疗提供新的靶点。方法：采用实时定量PCR方法检测50例临床诊断为心肌肥厚患者及25例正常健康人的外周血miR181b的水平，分析其表达水平与临床病理特征的关系。结果：miR181b在心肌肥厚患者外周血中表达（3.35±0.22）升高，差异有统计学意义（P<0.05）；体外大鼠原代心肌细胞在镜下呈多角形，采用α-横纹肌肌动蛋白抗体和DAPI进行免疫荧光染色，镜下90%以上细胞发出绿色荧光，表明原代培养心肌细胞纯度较高；采用去氧肾上腺素处理心肌细胞72 h后，心肌细胞总蛋白表达显著升高（P<0.05）；流式细胞术结果显示PE组心肌细胞大小明显增加（P<0.05）；实时定量PCR检测结果表明，PE组中心肌肥大相关基因β-MHC、α-SA、ANP显著升高（P<0.05），证明体外构建心肌肥大模型成功。结论：miR181b在心肌肥厚患者外周血中表达显著上调；体外成功培养乳鼠原代心肌细胞，通过PE处理法成功构建体外心肌肥大模型；在肥大心肌细胞中，miR181b与prkg-1 mRNA及蛋白的表达有显著相关性；miR181b可能通过调控prkg-1 mRNA及蛋白水平的表达参与心肌肥大，有望成为心肌肥厚临床诊断和治疗的新的靶点。

【关键词】心肌肥大； 心室重构； miR181b； PRKG1

①山东省枣庄市立医院 山东 枣庄 277100

②山东省枣庄市中医医院

First-author’s address： Zaozhuang Municipal Hospital， Zaozhuang 277100， China

心肌肥厚是很多慢性疾病的一个共同的临床病理性改变，主要发生在长期压力负荷过重的情况下，作为一种代偿方式。但这种代偿功能也有其不利之处，主要因为肥大的心肌需氧增加，而冠状动脉的供血量往往不能给予满足，造成心肌缺血，这将最后导致心肌收缩力的减退，是导致患者心衰进而引起死亡的重要原因[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 心肌肥大患者外周血采集 收集2012年1月-2014年3月在本院治疗的50例经心脏超声诊断有心肌肥厚的患者，男40例，女10例，年龄64～72岁，平均68.5岁，中位年龄67岁。根据高血压临床分级标准，50例患者经临床诊断均为高血压2级，病程均>5年，同时取25例健康人外周血清作为对照组。本研究经过枣庄市立医院伦理委员会批准，并得到受试者家属的知情同意。

1.1.2 试剂 血清RNA抽提试剂Trizol ls购自Invitrogen公司（加州、美国），组织细胞总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司（加州、美国），兔抗鼠PKG1多克隆抗体购自Santa cruz公司（波士顿、美国），Takara PrimeScript RT Regent Kit反转录试剂盒（大连、中国）；TaKaRa公司SYBR PrimeScript RT-PCR Kit荧光定量（大连、中国）；L-DMEM、MCDB131、胎牛血清（FBS）：美国GIBCO公司。α-横纹肌肌动蛋白抗体（α-sarcomeric actin antibody，α-SA），DAPI（Santa Cruz，美国）。去氧肾上腺素（PE）（Sigma-Aldrich，美国）；lipofectamine 2000购自Invitrogen （加州、美国）。

1.2 方法

1.2.1 血清总RNA提取 将患者外周血3000 r/min离心10 min，取上清；吸取血清250 μL，加入750 μL Trizol ls充分混匀，均采用酚氯仿法提取总RNA，分别通过RNA分子电泳、紫外分光光度计分析RNA 260/280比值检测RNA质量，取总RNA 1 μL，采取PolyA加尾法对miRNA进行逆转录；cDNA于-20 ℃冰箱保存。相关miRNA的逆转录按下列程序进行，在冰上预冷的RNase free EP管中加入RNA模板6 μL，2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1% BSA 2 μL，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL，总体积20 μL，37 ℃孵育60 min进行PolyA加尾和反转录反应，随后向上述RT反应液添加RNAase Free H2O 至100 μL，取2 μL进行定量检测。

1.2.2 SYBR Green荧光定量PCR 荧光定量PCR技术检测外周血中miR181b的表达水平，根据TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒说明书配置反应体系：10 μL qRT-PCR-Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL的cDNA 和8 μL ddH2O配置，每个样品设3个平行孔。反应程序为：预变性95 ℃ 10 min，40个循环：95 ℃ 1 min， 60 ℃30 s溶解程序验证特异性：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，内参基因采用U6。

1.2.3 心肌细胞的原代培养 取新生3 d的大鼠乳鼠，取出心室部位心肌组织，用眼科剪将其剪碎后，加入5 mL 0.5%胰蛋白酶和0.5%Ⅱ型胶原酶混合配成的消化液，37 ℃水浴消化5 min，取上清至含有2 mL小牛血清的离心管中，重复以上步骤2次，200 g离心5 min，弃去上清后，加入5 mL含10%胎牛血清的H-DMEM培养基，将细胞吹散并接种于25 mL培养瓶中，37 ℃，5%CO2孵箱中培养。

1.2.4 心肌细胞免疫组化 使用细胞爬片方法，制作心肌细胞切片，4 ℃下用冰丙酮固定1 h后，去离子水冲洗5 min，重复3次；用过氧化氢避光浸泡玻片20 min后，PBS冲洗两次；滴加羊血清（1∶200），37 ℃封闭1 h。滴加稀释的α-横纹肌肌动蛋白抗体（1∶200），4 ℃过夜；次日PBS清洗玻片3次，滴加FITC标记兔抗大鼠2抗（1∶200），37 ℃下孵育30 min，加DAPI，孵育5 min后采用激光共聚焦显微镜、倒置相差荧光显微镜下观察心肌细胞及荧光表达。

1.2.5 心肌肥大细胞模型的构建 心肌细胞原代培养第2天，向培养基中加入终浓度为100 μM的PE培养72 h，通过细胞免疫组化、细胞总蛋白量测定、心肌肥大相关基因检测、流式细胞术检测心肌细胞大小的方法对心肌肥大模型进行评估。

1.2.6 心肌细胞中miR181b与prkg1 mRNA的表达 搜集PE组及对照组心肌细胞，采用TRIzol法抽取RNA，逆转录为cDNA后，采用SYBR Green法检测心肌细胞miR181b与prkg1 mRNA的表达，prkg1 mRNA的定量PCR体系按照如下标准配置：SYBR EX Taq 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5μL，模板cDNA 2μL，ddH2O 10.5 μL；prkg1 mRNA 定量PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 s；40个循环：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。

1.2.7 心肌细胞中PKG1蛋白的表达 收集PE组、对照组的细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，制备细胞蛋白上清，与2×SDS上样缓冲液等量混合，沸水浴5 min后10 μL/孔上样，行100 V恒压SDS-Page电泳，300 mA恒流2 h冰浴电转至PVDF膜，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，加入适当浓度一抗（PKG1∶1000，GAPDH 1∶5000），4 ℃摇床孵育过夜，次日用PBST漂洗15 min×3次，加入HRP标记的二抗（羊抗鼠1∶3000，羊抗兔1∶1000）室温孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次，ECL发光液显影曝光。

1.2.8 miR181b inhibitor转染心肌细胞 采用脂质体法转染原代心肌细胞。实验分为对照组、NC、miRNA181b inhibitor组，均培养于不含抗生素10%胎牛血清的H-DMEM培养基，次日开始转染，取20 pmol/μL miR181b inhibitor 1.5 μL，lipo2000 1 μL分别加入含50 μL Opti Memi培养基的EP管中静置5 min后，将两管混匀，室温下静置20 min后加入培养孔，6 h后更换10%胎牛血清的H-DMEM培养基，采用定量PCR、WB检测48 h和72 h的各组细胞miRNA-181b及prkg1基因和蛋白PKG1表达水平；BCA法测定细胞总蛋白量、并通过流式细胞术检测细胞大小、采用定量PCR检测心肌肥大相关基因表达，观察转染前后心肌肥大的变化。

1.3 统计学处理 使用SPSS 15.0统计学软件分析数据，计量资料用（±s）表示，比较使用成组t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测心肌肥大外周血中miR181b表达 使用SYBR Green法分别检测心肌肥厚患者与健康人外周血miR181b的表达，结果显示健康人外周血中miR181b表达（1.12±0.21），心肌肥厚组（3.35±0.22）较健康人明显升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 原代心肌细胞的培养、心肌肥大细胞模型构建及鉴定 镜下观察原代乳鼠心肌细胞呈典型多角形，用α-横纹肌肌动蛋白抗体和DAPI对其进行免疫荧光染色后，在激光共聚焦显微镜和倒置相差免疫荧光显微镜下观察，心肌细胞呈现长梭形，呈节律性的收缩，蓝色为染色的细胞核，绿色荧光为细胞浆，绿色荧光细胞达到了90%以上，表明原代心肌细胞状态好，纯度高。终浓度为100 μM的PE处理原代心肌细胞72 h后，细胞免疫组化结果显示与对照组相比，原代心肌细胞显著肥大；PE组细胞总蛋白含量（180.22±10.21）显著升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测显示，PE组的心肌细胞明显增大（P<0.05）。定量PCR检测结果表明，PE组细胞心肌肥大相关基因β-MHC （2.92±0.41）、α-SA（3.78±0.34）、ANP（2.26±0.24）基因显著升高，比较差异有统计学意义（P<0.05），表明体外心肌肥大细胞模型构建成功。

2.3 PE组心肌细胞miR181b与prkg1 mRNA与蛋白PKG1表达 荧光定量PCR检测结果显示，与对照组（1.02±0.11）细胞相比，PE组miR181b表达（3.82±0.20）显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组（1.03±0.08）相比，PE 组prkg1 mRNA表达水平（0.33±0.18）明显下调（P<0.05）。免疫印迹检测PE组、对照组细胞PKG1蛋白（1.04±0.13）表达情况，结果显示PE组PKG1蛋白表达（0.26±0.15）显著降低，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 miR181b与PKG1蛋白表达对PE组心肌细胞的影响 使用定量PCR及Western blot检测转染miR181b inhibitor后PE组心肌细胞中miR181b 及prkg1 mRNA和蛋白的表达，结果显示转染组miR181b的表达（0.25±0.14）下调，差异有统计学意义，而prkg1 mRNA（1.28±0.13）未见明显改变；PKG1蛋白表达（3.12±0.14）显著增高，差异有统计学意义；对转染miR181b inhibitor的PE组心肌细胞肥大特征分析发现，miR181b表达下调后，心肌细胞总蛋白含量（138.28±15.13）下降；流式细胞术分析发现心肌细胞变小；心肌肥大相关基因β-MHC（0.58±0.16）、α-SA（0.49±0.26）、ANP （0.67±0.24）表达降低，差异有统计学意义。

3 讨论

心肌肥厚（Cardiomyocyte hypertrophy）是一种强有力的代偿形式，然而它不是无限度的，如果病因历久而不能被消除，则肥大心肌的功能便不能长期维持正常而终转向心力衰竭。目前认为，代偿性心肌肥大是一种不平衡的生长形式。这种在器官、组织、细胞、分子等不同的水平上都有其特征性表现的不平衡生长[2]，是肥大心肌转向功能不全的基础，是大多数心血管疾病发生发展中常见的一种病理生理变化，主要是因心脏的前后负荷的改变引起心肌细胞的适应性反应，若不加以临床治疗，最终将引起心肌纤维化导致心脏衰竭的发生。

心肌肥厚发生的分子机制非常复杂，涉及到了多种基因表达及蛋白功能的改变。研究表明，在机体压力负荷增加时，心肌细胞出现肥大改变，细胞内表现为蛋白合成增加、ATP分子合成旺盛、离子通道活性增强等[3-5]，是一种代偿性的应激反应。但是若心肌细胞持续处于肥大病理状态，会导致细胞基因表达及蛋白合成失调，线粒体、内质网等细胞器的损伤[6]，最终出现心肌细胞的死亡及间质的纤维化，导致了心脏衰竭的发生。已有文献显示，在心肌肥大的过程中，miRNA也起到了重要的调控作用，具有较复杂的作用机制[7]。研究表明，心肌细胞中miR-1上调能够调节心肌组织连接蛋白43的表达，从而抑制心肌肥大[8]。另一种miRNA分子-miRNA133被证实能够抑制肾上腺素及内皮素诱导的心肌肥大，其在肥大心肌细胞中表达下调[9]。此外文献[10]报道，miR-98、miR-9与心肌肥大的发生发展密切相关。

综上所述，可以认为miR181b可能通过调控prkg1基因的表达在心肌肥大过程中发挥重要作用。miR181b在心肌肥大患者外周血中表达升高；其表达下调后，原代肥大心肌细胞有逆转的迹象，提示miR181b可能成为心肌肥厚的临床诊断和治疗上一个新靶点。

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Inhibition of miR181b by up Regulation of PKG-1 in Rats with Myocardial Hypertrophy/

YANG J un，CAO Qian， ZHONG Wei， et al.//Medical Innovation of China，2016，13（01）：008-011

【Abstract】Objective： By detecting miR181b in expression of peripheral blood in the patients with myocardial hypertrophy， mechanism research and miR181b PRKG-1 in myocardial hypertrophy， for clinical diagnosis and treatment of cardiac hypertrophy provide new targets. Method： Using quantitative real-time PCR assay for the detection of 50 cases of clinical diagnosis for the level of peripheral blood miR181b patients with hypertrophic cardiomyopathy （HCM） and 25 normal healthy patients， to analyze the relationship between the expression level and clinicopathological characteristics. Result： The expression of miR181b in peripheral blood of patients with myocardial hypertrophy （3.35±0.22） increased， the difference was statistically significant （P<0.05）；in vitro primary rat myocardial cells were polygonal in microscope， using alpha sarcomeric actin antibody andbook=9,ebook=13DAPI immunofluorescence staining， microscope 90% above cells emitted green fluorescence the results showed that the cell， high purity of primary cultured myocardial cells； using the phenylephrine treatment after 72 h， the expression of the total protein of myocardial cells significantly increased （P<0.05）； flow cytometry showed that PE group myocardial cell size increased significantly （P<0.05）； real time quantitative PCR test results showed that，PE group of Central muscle hypertrophy related genes of beta -MHC -SA， ANP， alpha significantly increased （P<0.05）， that in vitro cardiac hypertrophy model. Conclusion： miR181b in peripheral blood of patients with myocardial hypertrophy expression is significantly up-regulated； primary cultured myocardial cells of neonatal rat culture successfully in vitro， through PE treat successfully construct in vitro model of cardiac hypertrophy； in cardiac myocyte hypertrophy， miR181b and prkg-1 mRNA and protein expression have significant correlation；miR181b may by regulation prkg-1 mRNA and protein level expression in cardiac hypertrophy， is expected to become a new target for diagnosis and treatment of myocardial hypertrophy.

【Key words】Cardiac hypertrophy； Ventricular remodeling； PRKG1； miR181b

收稿日期：（2015-09-02） （本文编辑：王宇）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.01.003

通信作者：杨军