人类微小RNA-208a的靶基因预测及生物学过程和信号通路的生物信息学分析

黎珊珊 钟国强 蒋智渊 温丽娜

(广西医科大学第一附属医院心血管内科，南宁市 530021，E-mail：xiaobaishanshan33@126.com)

论著·基础研究

人类微小RNA-208a的靶基因预测及生物学过程和信号通路的生物信息学分析

黎珊珊 钟国强 蒋智渊 温丽娜

(广西医科大学第一附属医院心血管内科，南宁市 530021，E-mail：xiaobaishanshan33@126.com)

目的 采用生物信息学技术预测人类微小RNA-208a(hsa-miRNA-208a)靶基因及分析其可能参与的生物学过程及信号通路。方法 应用miRbase数据库和UCSC Genome Browser分析工具获取hsa-miRNA-208a的染色体定位、碱基序列和物种保守性等基本信息，利用miRanda、miRDB、TargetScan和miRwalk进行靶基因预测，采用miRwalk网站对靶基因取交集，合并有文献支持和经实验证实的靶基因作为基因集，对基因集进行功能富集分析(GO分析)和信号通路分析。结果 hsa-miRNA-208a序列在各物种间高度保守。对TargetScan、miRDB、miRanda和miRwalk预测的靶基因进行交集后共得到16个靶基因(CPEB2、CSNK2A2、DLD、MTF2、FBXO28、LEP、SMAD4、NLK、GPR88、VPS13D、ZNF215、CHD9、SLC7A5、C19orf44、SLC45A3、MAP4K4)，miRwalk、DIANA Lab TarBase检索到已验证的靶基因分别为12个(CASP3、MRGPRX3、FPRL1、MED13、IL10、GATA4、HSH2D、MYH6、MYH7、TNNI3、CDKN1A、PAK3)和3个(SOX6、MTM1、TAB3)。GO分析结果显示靶基因富集于心室肌组织发育、心室形态发育、心腔发育、心肌发育、心脏发育以及细胞发育等生物学过程(P<0.05)；信号通路分析结果显示靶基因富集于黏附连接、紧密连接、心肌收缩、Wnt信号通路以及病毒性心肌炎、肥厚型心肌病和扩张型心肌病的相关信号通路中(P<0.05)。结论 hsa-miRNA-208a参与心脏生长发育的生物学过程，与心肌疾病的发生密切相关。

微小RNA-208a；人类；生物信息学；靶基因；心脏生长发育；心肌疾病

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约20～24个核苷酸的内源性、非编码RNA，它通过影响mRNA的稳定性和翻译，参与多细胞生物表达基因的转录后调控。成熟miRNA整合入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，miRNA 5′端第2～8个核苷酸(种子序列)通过与靶基因mRNA 3′非编码区序列完全或不完全互补联系于RISC，导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平负性调控靶基因的表达。近年来，对miRNA的研究已成为生命科学领域中的一个重要方向。miRNA分布广泛，参与的生物学过程复杂，调控的靶基因众多，因此研究miRNA的功能及作用机制有重要意义。目前确定miRNA靶基因的方法主要包括生物信息学软件预测和生物学实验方法[1]。生物信息学是一门交叉学科，它包含了生物信息的获取、处理、储存、分析和解释等内容，综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具来阐明和理解大量数据所包含的生物学意义[2]。预先进行生物信息学研究能为研究者提供较大的帮助，为后续实验提供思路，提高实验效率[3]。已有研究证实miRNA-208a与心房颤动、心肌肥厚、急性心肌梗死、查加斯病心肌病变、中东呼吸综合征及肌强直性营养不良等有关[4-9]，但其生物功能仍有待进一步阐明。本研究拟利用生物信息学方法对人类miRNA(homo sapiens-miRNA)-208a进行分析，为进一步研究其生物功能提供线索。

1 资料与方法

1.1 资料来源 使用PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)hsa-miRNA-208a相关文献进行检索，使用miRbase(http://www.mirbase.org/)数据库和UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/)分析工具获取hsa-miRNA-208a的染色体定位、碱基序列和物种保守性等基本信息。

1.2 研究方法 综合miRNAbase和UCSC Genome Browser 获取hsa-miRNA-208a的基本信息。利用miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRDB (http://www.mirdb.org/miRDB/)、TargetScan (http://www.targetscan.org/)、miRNAwalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)4种方法预测hsa-miRNA-208a靶基因后，使用miRNAwalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)对靶基因取交集。然后合并有文献支持以及由miRwalk和DIANA Lab TarBase检索到的经实验证实的靶基因共同作为进一步生物信息学分析的基因集合。使用基因本体(gene ontology，GO)分析网站(http://geneontology.org/)和DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对此基因集进行功能富集分析，并利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库(http://www.genome.jp/kegg/)进行信号通路富集分析，即得到基因集在GO类别上的高频率注释及有统计学意义的信号通路。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 has-miRNA-208a染色体定位及物种保守性分析 hsa-miRNA-208a定位于染色体14q11.2。使用miRbase检索到包括人类在内共10个不同物种的miRNA-208a成熟miRNA序列并进行分析，miRNA-208a的“AUAAGACGAGCAAAAAGC”18个碱基序列在这10个物种中高度保守，见表1。

表1 不同物种miRNA-208a成熟序列

注：mmu：mus musculus(小鼠)；rno：rattus norvegicus(大鼠)；mdo：monodelphis domestica(负鼠)；mml：macaca mulatta(猕猴)；ptr：pan troglodytes(黑猩猩)；bta：bos taurus(牛)；cfa：canis familiaris(犬)；eca：equus caballus(马)：ppy：pongo pygmaeus(猩猩)。

2.2 hsa-miRNA-208a靶基因预测TargetScan、miRDB、miRanda和miRwalk软件预测 hsa-miRNA-208a靶基因分别为2 799、548、4 757、634个，然后使用miRwalk对hsa-miRNA-208a靶基因进行交集(基于miRanda、miRDB、miRwalk、TargetScan)，共得到16个基因，分别为CPEB2、CSNK2A2、DLD、MTF2、FBXO28、LEP、SMAD4、NLK、GPR88、VPS13D、ZNF215、CHD9、SLC7A5、C19orf44、SLC45A3、MAP4K4。miRwalk中查到经验证的靶基因有12个，分别为CASP3、MRGPRX3、FPRL1、MED13、IL10、GATA4、HSH2D、MYH6、MYH7、TNNI3、CDKN1A、PAK3。DIANA Lab TarBase数据库中查到已收录的实验数据支持的靶基因有SOX6、MTM1、TAB3。2.3 hsa-miRNA-208a靶基因GO分析和信号通路分析结果 将预测的靶基因和已证实的靶基因进行合并后进行GO功能富集分析，结果显示这些靶基因富集在心室肌组织发育、心室形态发育、心腔发育、心肌发育、心脏发育、细胞发育过程以及细胞发育等生物学过程和功能上(P<0.05)，见表2。通过DAVID数据库对hsa-miRNA-208a靶基因集进行基于KEGG的信号通路富集分析，结果显示hsa-miRNA-208a靶基因富集在黏附连接、紧密连接、Wnt信号通路、心肌收缩通路等通路上，以及病毒性心肌炎、肥厚型心肌病和扩张型心肌病的疾病通路中(P<0.05)，见表3。

表2 hsa-miRNA-208a靶基因的GO富集分析结果

表3 hsa-miRNA-208a靶基因的Pathway分析结果

3 讨 论

自miRNAs的生物学活动在哺乳动物细胞中被描述以来，现已发现的miRNA超过2 500个，其中仍有1 000余个miRNAs的调控功能未被定义[10]。miRNA调控作用遍及生命体的各种活动中，对miRNA作用机制研究主要是针对其与靶基因的相互作用。尽管比较基因组学和高通量实验研究能预测一个miRNA在转录组的数百个结合位点，但样本稳定性和可重复性差、实验价格昂贵，且miRNA的表达受干扰后能导致多个预测靶基因和下游蛋白的微小变化，靶基因参与的调控机制也比较复杂，所以通过生物信息学对miRNA进行分析，预测其靶基因，并对其靶基因进行生物功能富集分析和通路富集分析，对确定miRNA的研究方向并指导生物实验尤为重要。

miRNA-208a是肌球蛋白基因编码的miRNAs家族中的一员，于2003年首次被发现，当时命名其为miRNA-208[11]。在2009年，发现miRNA-208b后miRNA-208重新命名为miRNA-208a。miRNA-208a在心脏细胞特异性高表达，由Myh6基因的29号内含子编码。其生理功能是协同miRNA-208b、miRNA-499参与控制心肌肌球蛋白含量、肌纤维特性和肌性能表现[12]。

本研究通过对多个物种间miRNA-208a成熟序列进行比对，发现多个种属间该序列高度保守，表明它可完成许多生命形式所必须的基本功能。同时，我们采用miRanda、miRDB、TargetScan和miRwalk软件进行靶基因预测，发现靶基因数目庞大，因此应用miRwalk软件筛选各预测软件的交集部分，并合并DIANA Lab TarBase数据库中已验证的靶基因，进行GO富集分析和基于KEGG的信号通路分析。GO富集分析显示hsa-miRNA-208a靶基因富集于心室肌组织发育、心室形态发育、心腔发育、心肌发育、心脏发育、细胞发育过程以及细胞发育等生物学过程和功能上。信号通路分析结果表明hsa-miRNA-208a存在黏附连接、紧密连接、心肌收缩、Wnt信号通路等通路上，以及病毒性心肌炎、肥厚型心肌病和扩张型心肌病的疾病通路中，hsa-miRNA-208a示其与心肌疾病的发生密切相关。目前其他学者也发现miRNA-208a表达异常主要是与各种心肌疾病的发生有关。其中，van Rooij等[13]研究发现miRNA-208a与心肌肥大、纤维化有关，且miRNA-208a通过调节靶蛋白—甲状腺激素受体相关蛋白参与压力负荷下心肌肥厚与纤维化。Callis等[14]通过研究再次证明miRNA-208a与心肌肥厚相关，且发现miRNA-208a过表达的转基因鼠出现房室传导阻滞，而敲除miRNA-208a基因的小鼠出现心房颤动，提示miRNA-208a是心脏正常传导所必需的，并与其调控唯同源异型结构域蛋白、锌指蛋白转录因子4和缝隙连接蛋白40有关。有学者通过尸检发现，与正常成人和胎儿相比，心肌梗死者心肌组织miRNA-208a表达上调，在心肌梗死者和胎儿心脏中miRNA的表达模式相似，提示在心脏重塑中心脏遗传因子发生了重编程[15]。另一项关于扩张型心肌病的研究结果显示，人心肌组织中miRNA-208a表达量与β-MHC的mRNA表达量以及心肌胶原含量有关，miRNA-208a表达升高提示预后不佳[16]。

综上所述，hsa-miRNA-208a参与心脏生长发育的生物学过程，与心肌疾病的发生密切相关。我们的研究结果提示，hsa-miRNA-208a除了与心肌病与缺血性心肌病变发生有关，可能在先天性心脏病和各种病理因素导致的心肌细胞凋亡中也起着重要的作用。此外，我们的研究还为进一步探索心肌病发生的下游信号通路(如MAPK/NKL 信号通路、TGF-β/Smad信号通路、Ca/Myosin信号通路)指出了潜在的方向。这对于我们进一步研究miRNA-208a在心血管疾病发生中的作用具有一定的指导意义。

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Prediction of target gene of homo sapiens-microRNA-208a and bioinformatics analysis of its biological processes and signaling pathways

LIShan-shan,ZHONGGuo-qiang,JIANGZhi-yuan,WENLi-na

(DepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To predict the target genes of homo sapiens-microRNA-208a(hsa-miRNA-208a),and analyze their possible biological processes and signaling pathways using bioinformatics technology.Methods Basic data of hsa-miRNA-208a including chromosomal location,base sequence and conservation of species were obtained using miRbase database and UCSC Genome Browser tool.The target genes were predicted using miRanda,miRDB,TargetScan and miRwalk.An intersection of target genes was acquired using miRwalk,and then was combined with the target genes supported by literature and confirmed by experiments as a target gene set,which were analyzed with Gene Ontology(GO) analysis and signal pathway analysis for target gene set.Results The sequence of has-miRNA-208a was highly conserved among various species.Sixteen target genes(including CPEB2,CSNK2A2,DLD,MTF2,FBXO28,LEP,SMAD4,NLK,GPR88,VPS13D,ZNF215,CHD9,SLC7A5,C19orf44,SLC45A3 and MAP4K4) were obtained from the intersection of target genes predicted by TargetScan,miRDB,miRanda and miRwalk.Twelve(CASP3,MRGPRX3,FPRL1,MED13,IL10,GATA4,HSH2D,MYH6,MYH7,TNNI3,CDKN1A and PAK3) and three(SOX6,MTM1 and TAB3) confirmed target genes were retrieved from miRwalk and DIANA Lab TarBase,respectively.GO analysis showed that the target genes were enriched in biological process including ventricular cardiac muscle tissue development,cardiac ventricle morphogenesis,cardiac chamber development,cardiac muscle tissue development,heart development,cell development,ect(P<0.05).The signal pathway analysis showed that the target genes were enriched in the pathways including adherent junction,tight junction,cardiac muscle contraction,Wnt signaling pathway,viral myocarditis,hypertrophic cardiomyopathy,dilated cardiomyopathy,ect(P<0.05).Conclusion Has-miRNA-208a participates in the biological process of cardiac growth and development,and is closely related to the occurrence of myocardial disease. 【Key words】 MicroRNA-208a,Homo sapiens,Bioinformatics,Target gene,Heart,Growth,Myocardial disease

黎珊珊(1990～)，女，在读硕士研究生，研究方向：心电生理学、心律失常及冠心病的基础研究及介入治疗。通信作者：钟国强(1958～)，男，博士，教授，研究方向：心电生理学、心律失常及冠心病的基础研究及介入治疗，E-mail：gq_zhong@126.com。

R 342.7

A

0253-4304(2016)12-1634-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.02

2016-05-28

2016-08-08)