D-葡萄糖同系物作为人类肝癌细胞BEL-7402荧光探针的价值▲

吕 良 唐焕焕 阳艳丽 苑 博 陈梦青 陈高建 张可锋卢 曦 钟明利 徐 庆 韦京辰 罗 艳 韦桂娇 蒋璐慧 段小群

(桂林医学院1 药学院，2 生物技术学院，桂林市 541004，E-mail：luliang998@163.com)

论著·基础研究

D-葡萄糖同系物作为人类肝癌细胞BEL-7402荧光探针的价值▲

吕 良1唐焕焕1阳艳丽1苑 博1陈梦青1陈高建1张可锋1卢 曦2钟明利1徐 庆1韦京辰1罗 艳1韦桂娇1蒋璐慧1段小群1

(桂林医学院1 药学院，2 生物技术学院，桂林市 541004，E-mail：luliang998@163.com)

目的 评价荧光D-葡萄糖同系物2-NBDG作为肝癌细胞BEL-7402荧光探针的价值。方法 肝癌细胞株BEL-7402培养24 h后分为实验组及对照组，其中实验组加入5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基，对照组加入不含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基，再将两组各分为两个亚组加入不同浓度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1 mmol/L)，即共4组：0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组、1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组、0.3 mmol/L 2-NBDG组、1 mmol/L 2-NBDG组。比较各组细胞荧光强度，分析2-NBDG在肝癌细胞BEL-7402中的摄取及荧光成像情况，以及D-葡萄糖对2-NBDG的抑制竞争作用。结果 0.3 mmol/L 2-NBDG组的相对荧光强度为(78.72±3.78)%，低于1 mmol/L 2-NBDG组的(100.00±8.23)%(P<0.05)。0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组的相对荧光强度为(20.67±1.46)%，明显低于0.3 mmol/L 2-NBDG组的(78.72±3.78)%(P<0.05)。1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组的相对荧光强度为(22.23±2.01)%，明显低于1 mmol/L 2-NBDG组的(100.00±8.23)%(P<0.05)。结论 2-NBDG可被肝癌细胞BEL-7402快速摄取，并可通过荧光强度的方式量化其摄取程度，D-葡萄糖可竞争性抑制肝癌细胞BEL-7402对2-NBDG摄取。2-NBDG可以作为人源肝癌细胞株BEL-7402的检测荧光探针。

肝癌；肝癌细胞BEL-7402；D-葡萄糖同系物；荧光探针；糖摄取；诊断

目前，原发性肝癌是临床上最常见的肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第5位，死亡率居全球第3位[1]。肝癌发病早期缺乏特征性症状，与多数消化道疾病的症状相似，因此很难在发病早期进行确诊[2]。传统恶性肿瘤的诊断是基于组织形态学的异常变化，通过CT、磁共振成像、超声检查等技术去辨认[3-4]。然而，对于恶性肿瘤细胞，其内部异常代谢的发生会早于外部形态的变化，其中细胞的糖酵解加速即是典型表现[5]。与此同时，恶性肿瘤细胞对葡萄糖的摄取也会相应地增多。因此，相关学者利用这一现象寻求更为灵敏的靶向检查肿瘤组织的新方法，如放射核素标记的葡萄糖同系物在肿瘤细胞中的快速摄取[4-6]。但利用放射核素标记技术有诸多缺点，如放射性核素垃圾难以处理和消除、不能直接检测单一的活细胞等[7]。荧光D-葡萄糖同系物{2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG}易于通过荧光显微镜观察，而不会带来放射风险[8]。本研究采用肝癌细胞BEL-7402为研究对象，评价2-NBDG在肝癌细胞中的摄取情况以及作为肝癌细胞BEL-7402荧光探针的价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 肝癌细胞BEL-7402(购自中山大学实验动物中心)，DMEM普通培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，2-NBDG(Invitrogen公司)，D-葡萄糖(天津科密欧化学试剂公司)，胰酶细胞消化液(碧云天公司)，荧光显微镜(莱卡DM2000)。

1.2 方法

1.2.1 BEL-7402细胞培养：用DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素培养细胞，细胞每隔3～5 d按1 ∶5比例进行传代。1.2.2 实验方法：将BEL-7402细胞进行计数，以每孔1×104的细胞数种在48孔板中。培养24 h后，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次后分为实验组及对照组，其中实验组加入含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基，对照组加入不含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基，再将两组各分为两个亚组加入不同浓度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1 mmol/L)，即共4组：0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组、1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组、0.3 mmol/L 2-NBDG组、1 mmol/L 2-NBDG组。4组BEL-7402细胞均在37℃下孵育20 min，再用PBS洗3次后在荧光显微镜下观察并摄像。实验重复3次。 利用IPP6.0软件计算各组细胞荧光强度。 1.3 统计学分析 应用 SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，比较均采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞摄入2-NBDG情况 2-NBDG孵育20 min后，在未加入D-葡萄糖的情况下，1 mmol/L 2-NBDG组细胞荧光强度大于0.3 mmol/L 2-NBDG组(图1 a-2及c-2)，即细胞荧光强度呈剂量依赖性增加。在0.3 mmol/L 2-NBDG组中，与未加入D-葡萄糖组比较，加入D-葡萄糖后，细胞荧光强度呈显著性减弱(图1 a-2及b-2)。在1 mmol/L 2-NBDG组中，与未加入D-葡萄糖组比较，加入D-葡萄糖后，细胞荧光强度显著性减弱(图1 c-2及d-2)。见图1。

图1 2-NBDG标记后BEL-7402细胞光学成像(200×)

a和b为加入0.3 mmol/L 2-NBDG的BEL-7402细胞，其中a-1为正常培养条件下的细胞白光图片，a-2为细胞荧光图片，b-1为添加5 mmol/L D-葡萄糖下的细胞白光图片，b-2为添加5 mmol/L D-葡萄糖的细胞荧光图片；c和d为加入1 mmol/L 2-NBDG的BEL-7402细胞，其中c-1为正常培养条件下的细胞白光图片，c-2为细胞荧光图片，d-1为添加5 mmol/L D-葡萄糖的细胞白光图片，d-2为添加5 mmol/L D-葡萄糖的细胞荧光图片。

2.2 不同2-NBDG浓度组BEL-7402细胞的相对荧光强度 2-NBDG孵育20 min后，以1 mmol/L 2-NBDG组为100%的相对荧光强度，0.3 mmol/L 2-NBDG组的相对荧光强度为(78.72±3.78)%，低于1 mmol/L 2-NBDG组的(100.00±8.23)%(t=4.000，P=0.011)。

2.3 5 mmol/L D-葡萄糖对BEL-7402细胞摄取0.3 mmol/L 2-NBDG的影响 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组的相对荧光强度为(20.67±1.46)%，明显低于0.3 mmol/L 2-NBDG组的(78.72±3.78)%(t=31.866，P=0.001)。

2.4 5 mmol/L D-葡萄糖对BEL-7402细胞摄取1 mmol/L 2-NBDG的影响 1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖组的相对荧光强度为(22.23±2.01)%，明显低于1 mmol/L 2-NBDG组的(100.00±8.23)%(t=17.326，P=0.001)。

3 讨 论

本研究结果显示，0.3 mmol/L 2-NBDG组及1 mmol/L 2-NBDG组的相对荧光强度分别为(78.72±3.78)%、(100.00±8.23)%，这表明肝癌细胞BEL-7402可以快速摄取2-NBDG，并且2-NBDG在该细胞上具有激发荧光的作用，其进入细胞内部后表现为聚集状态，这是己糖激酶将其6位C磷酸化的结果[9]，这也易于观察2-NBDG。而0.3 mmol/L 2-NBDG组的相对荧光强度低于1 mmol/L 2-NBDG组(P<0.05)，提示在2-NBDG一定剂量范围内，这种荧光强度与剂量(摄取量)成正比。此外，加入5 mmol/L D-葡萄糖后，0.3 mmol/L 2-NBDG及1 mmol/L 2-NBDG中BEL-7402细胞的相对荧光强度均明显降低(P<0.05)，这表明D-葡萄糖可影响肝癌细胞BEL-7402对2-NBDG的摄取，呈竞争性抑制荧光强度的作用。

2-NBDG是一种新型带荧光的葡萄糖类似物，在2位C原子位置有一个修饰过的2-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)氨基酸基团[6]。该荧光试剂激发荧光最佳波长为发射波长542 nm、激发波长467 nm。D-葡萄糖通过葡萄糖转运子(glucose transporter，GLUT)的转运进入细胞。已有实验证明，D-葡萄糖可抑制细胞摄取2-NBDG，而L-葡萄糖不会呈现类似的抑制效果，这表明2-NBDG和D-葡萄糖是通过竞争与GLUT的结合从而进入细胞[10-12]。研究表明，GLUT1在肿瘤细胞广泛表达，包括肝癌细胞[13-14]，因此，2-NBDG可以被这些广泛表达GLUT1的肿瘤细胞摄取，这与我们的实验结果是一致的。

本研究设计不足之处是没有设置正常肝细胞作为研究对照。但有相关文献报道，非肿瘤细胞对2-NBDG的摄取和聚集仅为肿瘤细胞的20%[15]。因此，2-NBDG是一种很好的荧光探针，已经在临床前和临床肿瘤靶向诊断、监测治疗效果和靶向治疗中被广泛研究[16-17]。

综上所述，2-NBDG可被肝癌细胞BEL-7402快速摄取，并可通过荧光强度的方式量化其摄取程度，D-葡萄糖可竞争性抑制肝癌细胞BEL-7402对2-NBDG摄取。因此，2-NBDG可作为肝癌细胞的葡萄糖代谢荧光标记应用于诊断体外培养的肝癌细胞BEL-7402，这种带荧光的葡萄糖类似物有望为肝癌的诊断和治疗提供新的方式。

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Value of 2-NBDG as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells

LYULiang1,TANGHuan-huan1,YANGYan-li1,YUANBo1,CHENMeng-qing1,CHENGao-jian1,ZHANGKe-feng1,LUXi2,ZHONGMing-li1,XUQing1,WEIJing-chen1,LUOYan1,WEIGui-jiao1,JIANGLu-hui1,DUANXiao-qun1

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiotechnology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To evaluate the value of D-glucose analog(2-NBDG) as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells.Methods BEL-7402 human hepatocarcinoma cell strains were divided into experimental group with 5 mmol/L D-glucose and control group without 5 mmol/L D-glucose after 24 hours of culture.The two groups were divided into subgroups,and then were added with 2-NBDG with different concentrations(0.3 mmol/L and 1 mmol/L).There were 4 groups obtained,including 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group,1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group,0.3 mmol/L 2-NBDG group and 1 mmol/L 2-NBDG group.The fluorescence intensities were compared among the 4 groups.The intake and fluorescence imaging of 2-NBDG in BEL-7402 human hepatocarcinoma cells were analyzed.And the competitive antagonism of 2-NBDG by D-glucose was also assessed.Results The relative fluorescence intensity of 0.3 mmol/L 2-NBDG group was (78.72±3.78)%,and was lower than that of 1 mmol/L 2-NBDG group[(100.00±8.23)%](P<0.05).The relative fluorescence intensity of 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group was (20.67±1.46)%,and was significantly lower than that of 0.3 mmol/L 2-NBDG group[(78.72±3.78)%](P<0.05).The relative fluorescence intensity of 1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group was (22.23±2.01)%,and was significantly lower than that of 1 mmol/L 2-NBDG group[(100.00±8.23)%](P<0.05).Conclusion BEL-7402 human hepatocarcinoma cells can intake 2-NBDG rapidly,and the intake can be assessed quantitatively by the fluorescence intensity.D-glucose might competitively inhibit the intake of 2-NBDG in BEL-7402 hepatocarcinoma cells.2-NBDG can be taken as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells. 【Key words】 Hepatocarcinoma,BEL-7402 hepatocarcinoma cell,2-NBDG,Fluorescent probe,Glucose intake,Diagnosis

国家自然科学基金(81460619)；广西科技基础条件平台建设项目(132907)

吕良(1980～)，男，博士，讲师，研究方向：药理学。

段小群(1972～)，男，博士，教授，研究方向：药物开发与药理学，E-mail：xiaoqunduan@163.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)02-0149-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.01

2015-11-01

2015-12-16)