不同组织源性干细胞向神经细胞分化的研究进展*

陈龙　李坤正　肖宗宇



不同组织源性干细胞向神经细胞分化的研究进展*

陈龙①李坤正②肖宗宇②

【摘要】随着神经干细胞（NeuralStemCells，NSCs）理论的提出，神经系统疾病的替代治疗有了广阔的应用前景。目前已经证实，许多组织中均存在干细胞，但是根据干细胞的组织来源不同，其向神经细胞分化的能力也有差异。本文就近几年来不同组织来源的干细胞向神经细胞分化的研究进展作一综述。

【关键词】神经干细胞；分化；干细胞；研究进展

①青海大学青海西宁810000

②青海大学附属医院

干细胞（StemCells，SCs）是指具有无限的自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞，具有广泛的临床治疗应用价值。随着干细胞理论的提出，为脑梗死、亨廷顿病、阿尔茨海默病等神经系统疾病的细胞移植治疗带来了新的希望。对于干细胞的替代治疗，最早提出的是利用神经干细胞（Neural StemCells，NSCs）进行替代，但NSCs取材困难，且存在着较多的伦理学问题，于是不少学者将目光转向了其他干细胞。目前，研究发现大多数组织中均存在干细胞，根据其部位不同可分别命名为胚胎干细胞（EmbryonicStemCells，ESCs）、骨髓间充质干细胞（BoneMarrowMensenchmalStem Cells，BMSCs）、脐带血间充质干细胞（Umbilical MensenchmalStemCells，UMSCs）、 脂 肪 干 细 胞（AdiposeTissueStemCells，ATSCs）以及外周血干细胞（PeripheralBloodStemCells，PBSCs）。本文就近些年来不同组织源性干细胞向神经细胞分化情况作一综述。

1　神经干细胞

神经干细胞（NSCs）是指分布于神经系统的、具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的一类细胞。其在神经系统中主要作为一种储备细胞，即当神经系统受到损伤时，如急性缺血性脑梗死、神经退行性疾病等，这些干细胞便开始增殖、迁移及分化为相应的组织细胞，以便实现结构和功能的代偿。NSCs不仅存在于哺乳动物的胚胎时期，同时也存在于成年动物的脑组织内。其进一步分化可形成神经祖细胞（progenitor）、胶质前体细胞（precursor）及相应的神经元（Neuron），但是物理或化学环境的不同，其向神经细胞分化的能力也不同。Zhao等［1］将小鼠神经前体细胞（NeuralPrecursorCells，NPCs）置于含20ng/mLEGF、10ng/mLbFGF、0.73U/mL肝素的无血清培养基（SFMC）中培养，第9天时发现NPCs分化为星形胶质细胞（astrocyte）、少突胶质细胞（oligodendrocyte）及神经元（Neuron）的比例分别为（59.4±3.6）%、（8.7±0.6）%及（8.2±2.2）%；随后在该分化条件下施加一直流电场（115v/m），实验组为施加连续2d的电场，持续2h/d，对照组未施加电场，培养第9天时发现实验组与对照组Nestin阳性比例分别为（13.6±2.0）%、（30.8±5.2）%，Nestin阳性比例下降提示施加一直流电场后显著提高了NSCs的分化效率，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，在分化所得的神经细胞中，实验组与对照组中β-tubulinⅢ的表达分别为（16.9±5.3）%和（8.2±2.2）%，比较差异有统计学意义（P＜0.01）；而GFAP及Olig2方面比较差异则无统计学意义（P＞0.05），提示该直流电场可以促进NSCs向神经元方向分化，而对于星形胶质细胞和少突胶质细胞则无明显影响。此外，物理性因素对干细胞分化也有一定程度的影响［2］。Arulmoli等［3］在诱导成年大鼠NSCs分化时，通过硅酮弹性体薄膜向NSCs施加适当的牵引力，结果发现，NSCs向神经元和星形胶质细胞方向的分化并未受到明显的影响，而向少突胶质细胞方向的分化明显减少，比较差异有统计学意义（P=0.001），提示机械牵引可以降低NSCs向少突胶质细胞的分化。尽管对于NSCs的研究已取得很大的成果，但就目前而言，干细胞移植仍然存在着诸多的问题亟待解决，主要包括：（1）如何让干细胞在体外完整的保存，以及如何控制其进一步分化的机制尚不完善；（2）干细胞移植尚无标准的方法及植入后相应的评价体系仍缺乏；（3）尚无有效的方法针对植入宿主后发生的免疫反应进行干预；（4）如何选择运载体并使目的基因按预期表达尚无定论。

2　胚胎干细胞

胚胎干细胞（ESCs）是指来源于着床前囊胚期的内细胞团（InnerCellMass，ICM）或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖细胞（PrimordialGermCell，PGC）中的一种多潜能细胞，在体外具有无限增殖和自我更新两大特征。有研究表明，在一定的诱导环境下，ESCs可定向分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元［4-5］。Noisa等［6］成功将hESCs转化得到人胚胎干细胞-神经前体细胞（hES-NPS），将所得hES-NPS置于含1%FCS的N2、B27培养基中培养，2周后发现β-tubulinⅢ和GFAP均呈阳性。若在N2培养基中改加弗斯可林（Forskolin）、血小板源性生长因子（PDGF）、三碘甲状腺氨酸（T3）及维生素C，则少突胶质细胞标志物Olig4呈阳性。此外，研究者将实验组hES-NPS置于含SHH、FGF8培养基中进行培养，并加入20ng/mLBDNF、20ng/mLGDNF、160μmol/L维生素C及0.5μg/mL层粘蛋白，免疫荧光下可见MAP2/TH阳性成熟神经元样结构，实验组与对照组（未加任何生长因子）MAP2/TH双阳性细胞分别占（10.6±1.2）%及（3.8±1.2）%，同时还证实所得多巴胺神经元表达NURR1，PITX3及EN1，推测其为中脑DA神经元，为hESCs用于临床提供了理论依据。Lee等［7］抑制了hESCs表面的一种糖蛋白PrPC（Prion Protein），然后将其置于DMEM中培养40d后发现，所得细胞TH、Olig1、GFAP的表达较对照组明显降低，比较差异有统计学意义（P＜0.05），结果说明抑制PrPC表达时，hESCs向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的分化会明显减少。此外，实验还观察了hESCs的分化与具体抑制PrPC时间点的关系，通过观察Syn、Olig1、GFAP的表达发现，hESCs的分化程度与PrPC被抑制的具体时间点无关，而与抑制持续的时间长短有关，当PrPC被全程抑制时，其Syn、Olig1、GFAP表达均呈阴性。由此说明，hESCs不仅可以分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，而且在分化过程中PrPC的表达起着重要的作用。此外，Stacpoole等［8］对不同氧浓度环境下hESCs向神经细胞分化的效率作了研究。实验发现，hESCs诱导形成Hb9阳性运动神经元时，3%氧气环境下所得细胞的Olig2表达是20%氧气环境下的2倍。同样，当诱导其形成中脑多巴胺能神经元时，其表达情况为3%氧环境下所得细胞EN1表达是20%氧环境下的5倍。说明hESCs在诱导分化时，3%氧气环境下比20%氧气环境下分化为神经细胞的效率更高。这一结论对ESCs用于临床有极大的使用价值。但目前将ESCs应用于临床替代治疗仍然存在着一些问题，如ESC的致癌性及是否形成畸胎瘤等。此外，临床应用ESCs替代治疗时，一定会涉及到细胞克隆技术及利用到人类早期胚胎等伦理学问题。诸多问题的限制，使ESC目前仅用于科研，难以临床推广。

3　骨髓间充质干细胞

间 充 质 干 细 胞（MensenchmalStemCells，MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，MSCs来源于中胚层间充质，主要存在于结缔组织及间质中，以骨髓组织中含量最高。目前，BMSCs跨胚层分化的具体机制仍然不太清楚，但有研究表明，BMSCs可以向神经细胞分化［9-10］。Hermann等［11］发现人BMSCs不仅可以分化为神经前体细胞，并且能够高水平表达原神经基因NeuroD1、Neurog2、MSl1、otx1及Nestin，并且前体细胞可继续分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。Qiu等［12］将TrkC、NT-3基因分别导入大鼠BMSCs体内，将转基因BMSCs置于含5%FBS的DMEM中培养14d，结果发现NT-3-MSCs和TrkC-MSCs共培养组Tju-1为（88.25±4.31）%明显高于其他组，比较差异有统计学意义（P＜0.05），此外，还观察到突触结构，推测转基因BMSCs已向神经元分化。Bonaventura等［13］将人BMSCs置于DMEM中进行悬浮培养，并添加0.5mM异丁甲基黄嘌呤（IBMX）、1mM双丁酰环磷腺苷（dbcAMP）、20ng/mL人表皮生长因子（hEGF）、40ng/mL碱性成纤维生长因子（bFGF）、10ng/mL神经营养因子（NGF）以及10ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF），10d后免疫荧光检测发现GFAP和Nestin呈阳性，推测有神经细胞形成。Nandy等［14］在诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化时发现，向培养基中加入10ng/mLFGF2所得多巴胺浓度为（69.1±3.9）pg/mL明显高于加入0.1μmol/L的ATRA所得多巴胺浓度时。此外，两种培养基中GFAP阳性率分别为5.5% 和8.3%，提示培养基中有星形胶质细胞形成。说明BMSCs在分化为神经细胞的过程中，加入的生长因子不同，其进一步向神经细胞分化的能力也有差异。虽然以上实验均证明BMSCs可以向神经细胞分化，但BMSCs在诱导分化过程中仍有不足之处，比如其特异性标记物目前尚缺乏、没有标准化的分离、培养及鉴定的方法等，此外，其分化效率也不太理想，以及分化所得的神经样细胞，是否具有神经电生理功能等尚处于未知，这些问题仍有待解决。

4　脐带血间充质干细胞

脐带血间充质干细胞（UMSCs）是指来源于围生期组织的一类不同于造血干细胞的、处于未分化状态的多潜能干细胞，在不同的诱导环境下，UMSCs可以分化为任何组织细胞。尽管UMSCs在形态学上及分化性能上与BMSCs有较多的相似之处，但是由于BMSCs的分化能力受到供者年龄的影响，所以相比之下UMSCs比BMSCs更优越。有研究表明，UMSCs在一定环境下可以分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞［15］。Bonaventura等［13］将hUMSC进行悬浮培养，并向培养基中加入1mol/LdbcAMP、0.5mol/L IBMX、20ng/mLhEGF、40ng/mLbFGF、10ng/mL NGF及10ng/mLBDNF，培养第6天时发现，培养基中呈现出两类细胞群：一类为胶质细胞，包括星形胶质细胞和少突胶质细胞；另一类在免疫荧光染色证实为神经样结构，细胞数量较少，体积较小、呈圆形，推测为双极神经元样细胞。第10天时，大约70%的细胞表现为GFAP、Nestin阳性。有研究将NTN基因和Lmx1a基因导入hUMSC中，并将其先后置于神经元前体细胞培养基和神经元诱导培养基中进行培养，第7天时发现，神经元前体细胞特异性蛋白（Nestin）表达呈阳性，第21天时，成熟神经元相关的特异性蛋白（NSE、MAP-2、β-tubulinⅢ）及多巴胺能神经元特异性抗原均呈阳性，而且此时Nestin表达明显降低［16］。提示hUMSC可以分化为神经细胞，而且在分化的过程中，先是形成神经前体细胞，然后再分化为神经元。此外，实验还将所得多巴胺神经元移植入PD猴模型体内，移植后猴PD症状明显缓解，推测移植的多巴胺神经元分泌了多巴胺。UMSCs在干细胞领域已经占据越来越重要的地位，由于其来源相对简便，免疫排斥反应相对较弱，无论是在科研领域还是用于临床，均有着广阔的应用前景。尤其是对于神经退行性疾病，目前临床仍无有效的治疗方案，UMSCs可以作为临床治疗的种子细胞之一，但治疗后的远期效果尚需观察，其安全性还有待进一步临床考证。

5　脂肪源性干细胞

脂肪源性干细胞（ADSCs）是存在于脂肪组织中的、具有无限增殖、多向分化潜能的一类干细胞。ADSCs来源于中胚层，在特定的环境下，可以分化为骨组织、软骨组织、肌肉组织和脂肪组织及包括神经组织在内的多种组织细胞。ADSCs体外培养相对简单，增殖周期短、来源较为丰富，且无伦理学及法律方面的限制，是一种理想的备选细胞。自2001年Zuk等［17］发现并命名脂肪干细胞以来，ADSCs因为其众多优点而成为了继骨髓源干细胞以后的又一大热门研究。近年来，大量的实验证明ADSCs可以向神经细胞分化［18］。Wrage等［19］将小鼠ADSCs首先置于含10%FBS的DMEM培养基中培养3d，3d后更换为10%FBS的NDM培养基，并向培养基中加入120μmol/L吲哚美辛、3mg/L胰岛素、300μmol/LIBMX，结果发现可检测到Nestin、GFAP、NSE及Tuj1，提示得到了神经样细胞。随后，应诚诚等［20］在Wrage实验的基础上进行了改善，向培养基中加入EGF、bFGF 及BDNF培养后发现，GFAP、β-tubulin表达阳性率分别为（74.0±3.3）%和（65.3±2.1）%。此外，Han等［21］将hADSCs和hBMSCs向神经元分化的能力进行了比较。实验将hADSCs和hBMSCs先置 于含1%FCS、10ng/mLbFGF和10ng/mLEGF的H-DMEM培养基中培养24h，然后在含20ng/mL BFGF、20g/mLEGF、20ng/mL睫状神经营养因子（CiliaryNeurotrophicFactor，CNTF）和6mg/mLRA 的H-DMEM中培养30d后观察发现：在0～7d，hADSCs与hBMSCs的MSCs形态特征开始逐渐消失，Nestin呈高表达状态，两者尼氏体含量分别是（2.1±2.5）%、（16.4±2.1）%；7d后，Nestin表达逐渐减少，hADSCs与hBMSCs中β-tubulinⅢ表达最高水平分别是（61.7±1.9）%和（63.9±0.8）%，说明hADSCs已经向神经细胞分化，而且与hBMSCs相比，其分化为成熟神经元的速度相对较慢。虽然目前关于ADSCs的分化研究较多，但是对于ADSCs用于临床替代治疗仍然存在许多问题，比如脂肪干细胞分化的机制仍不明确、如何持续保留ADSCs分化特性及移植的细胞是否有致瘤性等问题。然而，虽然存在众多问题，但其有着来源丰富、无伦理学及法律方面的限制等优势，这些研究必将被深入细化，随着细胞分子生物学的迅速发展，ADSCs在干细胞领域的移植治疗必定有着广阔的前景，无可替代。

6　外周血干细胞

外周血干细胞（PBSCs）是指释放到血液中的造血干细胞，通常仅占干细胞0.06%。外周血中造血干细胞即外周血干细胞同样具有干细胞的特点，具有分离获取较为简单、免疫源性相对较弱、无伦理学争议等一系列优点。目前已有研究的PBSCs主要为：CD34+造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSCs）、外周血间充质干细胞（PBMSCs）和单核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）。文献［22］报道，PBSCs在适当的微环境下可以分化为神经细胞。Wang等［23］将人外周血CD34+细胞通过病毒转染技术及培养后得到NSC，将所得NSC置于适宜的培养基中培养一段时间后分别得到了神经元（β-tubulinⅢ+）、星形胶质细胞（GFAP+）和少突胶质细胞（O4+），并证实β-tubulinⅢ（+）神经元为谷氨酸能神经元、GABA能神经元及多巴胺能神经元。Nichols等［24］从人外周血中分离出CD133+、ABCG2+、CXCR4+MSCs， 将 其 置 于DMEM-LG中培养，并向培养基中添加10%人血清、10-3M β-ME、5×10-7MRA，第7天时发现，实验组较对照组MSCs体积明显延长，并伴有较多的细胞突起，TH（45.2±9.7）%、Tuj1（35.23±7.9）% 和NEUN（28.2±11.1）%均明显高于对照组，GFAP （4.88±2.4）%稍高于对照组的（3.49±0.7）%，说明hPBMSCs在适宜的诱导环境下可向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞方向分化。目前对于PBSCs的研究相对较少，仍有众多问题亟待解决，比如如何提高PBSCs在体内存活率，如何有效的控制其定向分化，分化所得的神经样细胞是否具备电生理功能及PBSCs的安全性如何等。尽管如此，随着PBSCs研究的逐步深入，以及其操作相对简单、易获取且无伦理学限制等一系列优点，必将为基础及临床研究所青睐，成为神经系统疾病治疗中的另一个核心。

7　其他

除以上所述的干细胞外，近些年来造血干细胞（Hematopoieticstemcells）、表皮干细胞（Epidermal stemcells）、羊水源性干细胞（Humanamnioticfluid stemcells）和子宫内膜干细胞（Humanendometrium stemcells）等向神经细胞分化也有报道［13］。

综上所述，尽管ESCs为干细胞中最为典型的代表，但由于其取材于胚胎早期阶段，及伦理学和法律上的一些限制，致其科研及临床应用并不广泛。BMSCs由于其体外可扩增，加之取材相对容易，目前被众多学者所接受。但是对于BMSCs目前主要存在两大问题：一是骨髓中可获取的BMSCs数量太少，二是BMSCs的分化能力随着供者的年龄增长会逐渐降低［25］。UMSCs是介于ESCs与BMSCs之间的一类干细胞，其来源相对丰富，获取相对容易，且获取过程中无侵袭性及副作用。此外，较其他干细胞而言，UMSCs分化潜能较高，是目前干细胞科研及临床治疗的最佳选择。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.040

*基金项目：青海省科技创新能力促进计划项目（2015-ZJ-943Q）

通信作者：李坤正

收稿日期：（2016-01-18）（本文编辑：李颖）