局部注射超声微泡促进BMP 2在大鼠体内骨骼肌表达的研究

郭琳琦　刘亮　栗树伟　李岩　王东



局部注射超声微泡促进BMP 2在大鼠体内骨骼肌表达的研究

郭琳琦刘亮栗树伟李岩王东

【摘要】目的 分析局部注射超声微泡对BMP 2在大鼠体内骨骼肌中表达的促进作用。方法 将30只大鼠平均分为1组（空白对照）、2组（直接注射质粒）、3组（注射质粒目的基因＋微泡），并向三组大鼠股四头肌中注射造影剂、生理盐水和BNM 2-EGPF，每组再分为A、B组，于7 d、14 d分别处死大鼠，检测BMP 2的表达状况。结果 7 d后，3组中A组大鼠的BMP 2阳性表达率高于1组中A组大鼠和2组中A组大鼠（P＜0．05），14 d后，3组中B组大鼠的BMP 2阳性表达率高于1组中B组大鼠和2组中B组大鼠（P＜0．05）。结论 局部注射超声微泡能够提高BMP 2在大鼠骨骼肌中的表达含量，可为临床治疗骨折疾病提供新思路。

【关键词】超声微泡；BMP 2；骨骼肌；作用

近年来，不断有临床研究发现，局部注射超声微泡能够促进目的基因安全且有效的定向转移，继而能够有效增加外源性基因表达量，在基因治疗领域中发挥着重要的应用价值[1]。BMP 2（骨骼形态发生蛋白-2）是一种具有强效性的骨诱导因子，在骨折后的骨愈合过程中发挥着重要作用[2]。基于上述现状，本次研究针对局部注射超声微泡对BMP 2在大鼠体内骨骼肌中表达的促进作用进行了分析，旨在为临床治疗骨折疾病提供新思路，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物

实验动物为30只健康雄性SD大鼠，清洁级，体重170～190 g。

1.2实验方法

将目的基因BMP 2-EGPF导入大肠杆菌DH 5 a后进行基因扩增筛选，按照Promega提抽试剂盒说明书进行质粒提纯，建立双酶切反应体系鉴定DNA质粒，调整质粒浓度。制备微泡后将30只大鼠平均分为1组、2组和3组，1组大鼠作为空白对照组，2组大鼠直接注射质粒，3组大鼠注射目的质粒基因＋超声微泡造影剂。然后将超声微泡造影剂、生理盐水和已定量转化的BMP2-EGPF混合，注入三组大鼠股四头肌中，注射量为30 μ，后用超声将超声微泡局部超声破裂，超声频率设置为1 MHz，声强设置为0.5 W/cm2，超声探头每次发射1 s，间断1 s。将各组大鼠平均分为A组和B组，于7 d后处死各组大鼠中的A组大鼠，于14 d后处死各组大鼠中B组大鼠。取各组大鼠股四头肌，使用石蜡包埋固定，冰冻肌肉组织，切片，应用免疫组化技术检测各组大鼠股四头肌中BMP 2的阳性表达状况。

1.3BMP 2阳性表达判断标准

BMP 2阳性表达时呈棕黄色，为颗粒状。随机性选取5个100倍视野，对每个高倍视野免疫组化染色阳性表达进行定量分析，每个视野取100个颗粒。颗粒无着色为0分，浅黄色、棕黄色、棕褐色分别为1、2、3分，0分为阴性，1分（浅黄色颗粒＜10%），2分（棕黄色颗粒11%～50%）、3分（棕褐色颗粒51%～75%）、4分（着色颗粒＞75%），任意两者乘积≥3分即判定为阳性。

1.4统计学方法

所得数据使用统计学软件SPSS13.0进行处理分析，计数资料用（n，%）表示，采用χ2检验、计量资料用（x-±s）表示，采用t检验，P＜0.05，差异具有统计学意义。

2　结果

2.11组中A组、2组中A组、3组中A组大鼠的BMP 2阳性表达率比较

免疫组化染色结果显示，1组中A组5只大鼠股四头肌中的BMP 2均呈阴性表达。2组中A组5只大鼠，2只大鼠股四头肌中的BMP 2呈阳性表达，阳性表达率为40.0%。3组中A组4只大鼠股四头肌中的BMP 2呈阳性表达，阳性表达率为80.0%，高于其他两组中的A组大鼠（χ2=10.000；P=0.002，χ2=4.011；P=0.046）。2.21组中B组、2组中B组、3组中B组大鼠的BMP 2阳性表达率比较

免疫组化染色结果显示，1组、2组、3组大鼠中B组大鼠股四头肌的BMP 2阳性表达只数分别为1只、3只、5只，阳性表达率分别为20%、60%和100.0%。3组中B组大鼠股四头肌的BMP 2阳性表达率高于其他两组大鼠中的B组大鼠（χ2=6.667；P=0.010，χ2=4.577；P=0.029）。

2.31、2、3组大鼠BMP 2阳性表达率综合比较

总结上述研究结果得出三组大鼠中，每组B组大鼠BMP 2阳性表达率均高于A组，3组中B组大鼠的BMP 2阳性表达率最高，其次为3组A组，2组B组，2组A组，1组B组，1组A组大鼠的BMP 2为阴性表达，上述指标之间存在的差异均具体统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

机体骨体骨折后被破坏的骨质如何快速再生一直是我国临床重点研究课题之一。BMP 2因具有独特的性质也吸引了各国临床的高度关注[3]。BMP 2在骨质中的高含量表达，可加快骨折患者骨体骨折端愈合，因此认为通过转基因方式诱导BMP 2表达，有可能成为治疗骨折疾病的新方法。

局部注射超声微泡是近年来新发现的一种体内基因转染载体，在一定条件下可将目的基因安全而有效的进行定向转移，增加外源性基因表达量。但关于超声微泡在基因转染中的具体作用机制却尚未完全明确[4]。研究学者认为[5]，在超声作用下，微泡造影剂能够通过不断压缩和膨胀形成“空化效应”，降低超声波空化阈值，当超声波达到一定强度时，微泡发生破裂，并将携带的目的基因释放，促使目的基因进入机体细胞，增加外源性基因表达量。

我院本次研究对局部注射超声微泡在促进大鼠骨骼肌中BMP 2表达的作用进行了分析，结果显示3组大鼠中A组大鼠的BMP 2阳性表达率高于其他两组大鼠中的A组大鼠，3组大鼠中B组大鼠的BMP 2阳性表达率高于其他两组大鼠中的B组大鼠。本次研究所得结果表明局部注射超声微泡可提高BMP 2在大鼠骨骼肌中的表达量，有助于研究学者确定利用局部注射超声微泡进行基因治疗的可行性。但由于我院本次研究使用的实验动物样本较少，因此所得研究结果的可靠性仍需大量临床研究进行验证。

参考文献

[1] 唐远姣，张凌燕，王磊，等． 治疗性超声介导微泡破裂促进大鼠体内肌肉基因转染的参数优化实验研究[J]． 四川大学学报（医学版），2012，43（6）：930-935．

[2] 白园园，修建成，刘伊丽，等． 超声空化微泡效应促进缺血骨骼肌血管新生的机制[J]． 实用医学杂志，2014，9（15）：2367-2370．

[3] 崔海，徐亚丽，吴盛正，等． 微泡超声空化声压幅度与大鼠血脑屏障通透性关系的研究[J]． 中华超声影像学杂志，2015，15（8）：715-719．

[4] 唐远姣，向茜，冷钱英，等． 超声联合微泡促进大鼠损伤跟腱及肉芽组织局部基因转染的实验研究[J]． 四川大学学报（医学版），2014，45（6）：979-983，1009．

[5] 景香香，刘洁，杨炳昂，等． 超声微泡介导EGFP转染正常大鼠关节滑膜组织的研究[J]． 中国超声医学杂志，2011，27（3）：203-205．

To Sutdy the Local Injection of Ultrasound Microbubble Promote BMP 2 Expression in Rat Skeletal Muscle

GUO Linqi LIU Liang LI Shuwei LI Yan WANG Dong, Shanxi Medical University, Taiyuan 030002, China

[Abstract]Objective To analysis the local injection of ultrasound microbubbles promoting the role of BMP 2 in expression in rat skeletal muscle. Methods Selected 30 rats were divided into group 1 (blank control), group 2 (direct injection of plasmid), group 3 (injection of plasmid, microbubble target gene), the three groups of rats injected contrast quadriceps agents, saline and BNM 2-EGPF, each group was divided into A, group B, in 7 days, 14 days rats were sacrificed to detect the expression of BMP 2 situation. Results 7 days, group 3 of rats in group A the BMP 2 expression was higher than in group A group 1 and group 2 rats in group A (P＜0.05), 14 days, group 3 of rats in group B the BMP2 expression was higher than in group B group 1 and group 2 rats in group B (P＜0.05). Conclusion Local injection of ultrasound can improve the content of BMP 2 expression in rat skeletal muscle, may provide new ideas for the clinical treatment of fractures disease.

[Key words]Ultrasound microbubbles, BMP 2, Skeletal muscle, Effect

通讯作者：王东，E-mail：30409774@qq．com

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．04．018

【文章编号】1674-9308（2016）04-0025-02

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

作者单位：030002太原，山西医科大学