子宫腺肌病患者增生期及分泌期子宫结合带组织中GPR30、EGFR的表达观察

周俊杰，孔红霞，刘燕，陈雁南，杨立

(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

子宫腺肌病患者增生期及分泌期子宫结合带组织中GPR30、EGFR的表达观察

周俊杰，孔红霞，刘燕，陈雁南，杨立

(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

目的 观察子宫腺肌病患者增生期及分泌期子宫结合带(JZ)组织中G蛋白偶联受体30(GPR30)和表皮生长因子受体(EGFR) mRNA和蛋白的表达变化，并探讨其与子宫腺肌病发病的关系。方法 42例行子宫全切术或子宫次全切术的患者中，25例子宫腺肌病患者(病例组，14例留取增殖期组织、11例留取分泌期组织)，17例宫颈病变或卵巢良性肿瘤患者(对照组，9例留取增殖期组织、8例留取分泌期组织)。获取两组JZ组织，采用实时荧光定量PCR法检测GPR30、EGFR mRNA，采用免疫组化二步法检测GPR30、EGFR蛋白。结果 对照组增生期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA相对表达量及GPR30、EGFR蛋白阳性表达率均高于分泌期组织(P均<0.05)；病例组增生期、分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA相对表达量及GPR30、EGFR蛋白阳性表达率差异均无统计学意义；病例组分泌期JZ组织中EGFR mRNA相对表达量、GPR30蛋白阳性表达率高于对照组(P均<0.05)。结论 子宫腺肌病患者增生期和分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA及蛋白表达差异无统计学意义，GPR30、EGFR mRNA及蛋白的无周期性规律表达可能与子宫腺肌病的发病有关。

子宫腺肌病；子宫结合带；G蛋白耦联受体30；表皮生长因子受体

子宫结合带(JZ)是由子宫基底层内膜和内1/3肌层构成的区域。子宫内膜和内膜下肌层是在物种进化中保守的结构功能单位，均为副中肾管起源，属于“古子宫”；与之对应的，内膜下肌层之外的非副中肾管起源的平滑肌层构成了“新子宫”。子宫腺肌病是子宫内膜向子宫肌层生长导致的，其发病机制尚未明确。研究[1]认为子宫腺肌病是“古子宫”全层结构或功能异常的疾病。子宫腺肌病作为激素依赖性疾病，其发生与雌激素调节紊乱有关。G蛋白偶联受体30(GPR30)作为功能性的膜受体参与雌激素的非基因组信号转导，可作为独立的雌激素膜受体在雌激素信号转导及细胞生长、增殖和凋亡中发挥重要作用。表皮生长因子受体(EGFR)是G蛋白、细胞因子受体和整合素等多种信号通路的交汇点，介导细胞的生长、增殖、分化、黏附等生命活动，在机体的发育过程中起重要作用[2]本研究观察了子宫腺肌病患者增生期及分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA和蛋白的表达变化，并探讨其与子宫腺肌病发病的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年6月～2016年2月在郑州大学第三附属医院行子宫全切术或子宫次全切术的患者42例，排除合并内异症、子宫内膜息肉及子宫肌瘤者，排除合并内分泌、免疫系统疾病和代谢性疾病者，术前3个月均未行激素类药物治疗。其中，25例子宫腺肌病患者(除外合并子宫肌瘤)为病例组，患者年龄35～52(44.7±0.8)岁，14例留取增殖期组织、11例留取分泌期组织；17例宫颈病变或卵巢良性肿瘤为对照组，患者年龄37～53(46.0±1.2)岁，9例留取增殖期组织、8例留取分泌期组织。两组患者均月经周期规律，一般资料具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准。患者术前均签署知情同意书。

1.2 JZ组织取材方法 参考文献[3]方法将术中切下的子宫腔Y字形剖开，先轻轻刮取子宫内膜，在内膜基底层下5～8 mm内取材作为JZ层。取1 cm3的组织标本，分为两部分，一部分立即置入液氮罐中保存，用于实时荧光定量PCR检测；余下部分用甲醛常规固定，用于免疫组化染色。

1.3 JZ组织中GPR30、EGFR mRNA检测 将JZ组织剪碎，参照TRIzol法抽提RNA，经逆转录反应生成cDNA。引物序列由奥科鼎盛生物公司合成。GPR30 mRNA上游引物序列为5′-CCTCACGGGCCACATTGTCA-3′，下游引物序列为5′-ACTGCTCGGTGCTGTCTGGAAT-3′；EGFR mRNA上游引物序列为5′-GCCAAGGCACGAGTAACAAG-3′，下游引物序列为5′-AGGGCAATGAGGACATAACCA-3′；内参β-actin基因上游引物序列为5′-GCGGGAACTGCCTGACT-3′，下游引物序列为5′-CTCGTTGCCGATGGTGAT-3′。将生成的cDNA加入20 μL SYBR Green I实时荧光定量PCR的混合体系采用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增。参考文献[4]方法，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.4 JZ组织中GPR30、EGFR蛋白检测 将JZ组织标本常规包埋、脱蜡和水化。分别加入GPR30抗体(1∶80)和EGFR抗体(1∶50)过夜。采用免疫组化二步反应法进行染色，以PBS代替一抗作阴性对照，高倍镜(400×)下观察染色结果。每张切片至少观察5个高倍镜视野，以细胞质和(或)细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性细胞染色。按染色强度和阳性细胞百分比进行结果判定：无色计0分，轻度着色计1分，中度着色计2分，重度着色计3分；阳性细胞百分比<5%计0分，5%～<25%计1分，25%～<50%计2分，≥50%计3分；上述两项评分乘积>3为蛋白表达阳性，≤3为蛋白表达阴性。

2 结果

2.1 两组增生期及分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA表达比较 对照组增生期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA相对表达量高于分泌期组织(P均<0.05)；病例组增生期、分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA相对表达量相比，P均>0.05；病例组分泌期JZ组织中EGFR mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)。详见表1。

表1 两组增生期及分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA相对表达量比较±s)

2.2 两组增生期及分泌期JZ组织中GPR30、EGFR蛋白表达比较 GPR30、EGFR蛋白在JZ组织中均有表达，GPR30主要定位于细胞膜、部分表达于细胞质，EGFR在细胞膜和细胞质中均有表达。病例组增生期、分泌期JZ组织中GPR30蛋白阳性表达分别为13、8例，EGFR蛋白阳性表达分别为12、10例；对照组增生期、分泌期JZ组织中GPR30蛋白阳性表达分别为7、1例，EGFR蛋白阳性表达分别为8、1例。对照组增生期JZ组织中GPR30、EGFR蛋白阳性表达率高于分泌期组织(P均<0.05)；病例组增生期、分泌期JZ组织中GPR30、EGFR蛋白阳性表达率相比，P均>0.05；病例组分泌期JZ组织中GPR30蛋白阳性表达率高于对照组(P<0.05)。

3 讨论

子宫腺肌病是由于JZ缺少子宫内膜下层组织的保护作用，内膜直接侵入与之紧密相连的子宫肌层，使JZ组织排列紊乱，同时伴有子宫平滑肌细胞反应性增生所致。JZ结构及功能破坏是子宫腺肌病发病的病理生理基础。子宫腺肌病患者的JZ存在组织形态改变。MRI检查示JZ弥漫性增厚超过12 mm则高度怀疑子宫腺肌病。子宫腺肌病患者的JZ在MRI图像呈现弥漫性增厚的低信号强度区域，目前认为JZ增厚是平滑肌细胞过度增生引起[3]。1983年，Hricak等[5]首次借助MRI检查提出“古子宫”的概念。研究证实，子宫腺肌病存在“古子宫”全层结构或功能异常。JZ作为“古子宫”的一个重要区域，是子宫内膜层和肌层间的重要连接组织。与“新子宫”相比，JZ对局部雌激素变化非常敏感。

一直以来，人们对雌激素作用途径的研究主要集中在雌激素核受体通路上，认为雌二醇(E2)引起的转录应答完全由雌激素受体(ER)介导，即雌激素通过基因组效应，激活细胞内信号级联反应，引起细胞生物学改变(如影响细胞周期)，从而导致细胞结构和功能改变。正常情况下，细胞在多种机制下短暂激活EGFR对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，可以防止因磷酸化激活下游产物ERK-1/2；而通过去磷酸化下调ERK-1/2表达，持续激活EGFR-MAPK通路则可能导致细胞过度增殖甚至发生癌变[6]。

越来越多的研究显示，雌激素可通过结合雌激素膜受体GPR30快速激活细胞信号转导通路及下游效应分子[7]，介导雌激素的快速非基因组效应[8，9]。GPR30基因位于染色体7p22，其mRNA全长为2 604 bp，编码含375个氨基酸的蛋白。GPR30是7次跨膜G蛋白耦联受体超家族的成员之一，其与传统雌激素受体没有同源性[10]，参与信号转导的途径主要有磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途径和MAPK途径[11]。GPR30通过促使肝素结合表皮生长因子，反向激活EGFR，介导下游的EGFR家族激活蛋白激酶或脂质激酶的级联反应，促进细胞增殖与分化，最终导致细胞功能变化[12]。GPR30还能单独介导雌激素激活EGFR，使ER阴性的乳腺癌细胞对雌激素敏感[13]。在多种雌激素依赖性疾病中，GPR30呈高表达并参与E2介导的雌激素效应，如刺激细胞增生、增强细胞迁移能力、调控细胞凋亡等[14,15]。

本研究选取育龄妇女的JZ组织作为研究对象，证实了GPR30和EGFR在JZ组织均有表达，且主要位于细胞质和(或)细胞膜中，这与GPR30作为雌激素细胞外信号转导受体的理论相吻合[12]。研究发现，在正常妇女子宫内膜中，GPR30在增生期内膜的表达水平高于分泌期内膜，呈周期性变化，推测这种变化与其介导的雌激素效应刺激子宫内膜增生有关[8]。而本研究病例组中GPR30 mRNA及蛋白的表达无明显周期性变化，呈持续高表达，这一变化可能与子宫腺肌病患者的JZ组织失去了雌激素的正常调控有关。GPR30在JZ组织中持续高水平表达可能使局部组织出现高雌激素状态。GPR30可能通过雌激素介导的快速非基因效应诱导JZ组织异常增殖和分化，导致JZ组织稳定性遭到破坏，促进子宫腺肌病的发生。本研究发现病例组分泌期JZ组织中EGFR mRNA表达较对照组增强，说明EGFR对子宫腺肌病的发病有重要作用。近年来研究发现雌激素能促进EGFR的合成,提高EGFR的感受性，使得与其受体结合后，通过其促有丝分裂作用而促进细胞生长与增殖。

本研究结果显示，子宫腺肌病患者增生期和分泌期JZ组织中GPR30、EGFR mRNA及蛋白表达差异无统计学意义，GPR30、EGFR mRNA及蛋白的无周期性规律表达可能与子宫腺肌病的发病有关。这为研究GPR30信号转导通路与子宫腺肌病的关系提供了依据。但由于本研究纳入样本量有限，上述结论和推测尚待进一步证实。

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