不同海拔高原环境下生存的小鼠脾脏T淋巴细胞亚群变化

张晓娜，高世兰，胡方杰，李积东，蒲小燕，永胜

(青海大学医学院，西宁 810001)

不同海拔高原环境下生存的小鼠脾脏T淋巴细胞亚群变化

张晓娜，高世兰，胡方杰，李积东，蒲小燕，永胜

(青海大学医学院，西宁 810001)

目的 观察不同海拔高原环境下生存的小鼠脾脏T淋巴细胞亚群变化。 方法 分别在400 m、2 200 m和4 200 m的不同海拔条件下饲养小鼠30 d，用流式细胞术(FCM)检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布及其表面活化共刺激分子的变化。 结果 海拔4 200 m和海拔2 200 m低氧暴露30 d后，小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例较对照组(海拔400 m)显著下降(P均<0.05)，其中，CD4+T细胞数较CD8+T细胞数下降水平高；CD4+CD28+T细胞比例也明显减少(P<0.05)，而CD8+CD28+T细胞比例无显著变化。此外，海拔4 200 m低氧组与海拔2 200 m低氧组相比，小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD4+CD28+T细胞数均明显下降(P<0.05)。 结论 高原环境饲养可以导致小鼠脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞数量减少，CD4+T淋巴细胞活化水平显著降低。海拔越高作用越明显。

高原环境；T淋巴细胞；淋巴细胞亚群；白细胞分化抗原;脾

高原地区自然环境恶劣，大气压低、氧分压低、气候寒冷、辐射强，可以导致高原病，低氧是其中最重要的因素[1，2]。免疫系统是机体的防御屏障。研究表明，高原低氧环境可改变机体免疫功能[3]，表现为T细胞成熟延缓，增殖被抑制，分泌细胞因子的能力也发生改变[4，5]。脾脏作为最大的外周免疫器官，不仅是成熟T、B淋巴细胞等免疫细胞定居的部位，也是产生特异性体液免疫和细胞免疫的场所[11]。目前高原低氧环境对脾脏T细胞亚群分布的影响尚不明确。2016年3～10月，我们观察了不同海拔高原低氧环境对小鼠脾脏T细胞亚群分布的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性BALB/c小鼠30只，4～6周龄，体质量20～25 g，购于西安交通大学医学院动物实验中心。红细胞裂解液(Solarbio，北京)；PBS(Hyclone，美国)；anti-Mouse CD3PE、anti-Mouse CD4FITC、anti-Mouse CD8PerCP、anti-Mouse CD28FITC、anti-Mouse CD28PerCP(Ebioscienc，美国)。生物安全柜(Thermo Scientific 1300 SERIES A2，美国)；小型台式离心机(Eppendorf 5148R，德国)；FCM(BD FACS Calibur,美国)。

1.2 小鼠分组及饲养 将小鼠随机分为A、B、C组，每组10只。A组小鼠饲养于青海省果洛州甘德县青珍乡(海拔4 200 m),B组饲养于青海大学基础医学研究中心(位于青海省西宁市，海拔2 200 m)，C组大鼠饲养于西安交通大学医学院(位于陕西省西安市，海拔400 m)。三组小鼠饲养环境相同。均喂养30 d。

1.3 小鼠脾脏T淋巴细胞亚群检测 脱颈处死小鼠，用75%乙醇浸泡5 min，超净工作台内打开腹部左侧皮肤，小心分离皮下组织和腹壁肌肉，露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织。脾脏放入含2 mL PBS的无菌培养皿中，剪成三段，无菌镊子夹碎，挤压脾脏。将获得的细胞悬液经200目尼龙网过滤加入无菌试管，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入适量红细胞裂解液裂解红细胞，混匀后静置5 min，待红细胞完全破碎，1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗1～2遍。最后用1 mL PBS重悬细胞，调整浓度为1.5×106/mL。 将细胞悬液与荧光单抗混合，分别制备阴性对照管和样品管，混匀后避光放置25 min，离心弃上清，用2 mL PBS洗两遍，最后用500 μL PBS重新悬浮。用文献[12，13]中的方法行流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD28+、CD8+CD28+T细胞比例及CD4+/CD8+。

2 结果

饲养30 d时三组小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布见表1。饲养30 d时，与C组相比，A、B组小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD28+T细胞比例低(P均<0.05)；与B组相比，A组小鼠上述指标低(P均<0.05)；三组CD8+CD28+T细胞比例和CD4+/CD8+相比,P>0.05。

表1 饲养30 d时三组小鼠脾脏T淋巴细胞亚群比较±s)

注：与C组相比，＊P<0.05；与B组相比，△P<0.05。

3 讨论

高原地区自然环境恶劣，大气压低、氧分压低、寒冷、辐射强等因素容易引起高原病，低氧为其最主要的特征。低氧不仅能改变机体的一系列生理机能，同时也是许多疾病,如休克、癌症、免疫性疾病等发生发展过程中的病理环节之一[1]。人在快速进入3 000 m以上高原后由于缺氧会发生急性高原反应，严重者可能发展为高原肺水肿和高原脑水肿[2]，甚至危及生命。

免疫系统是机体的防御屏障。研究表明，高原低氧可使机体免疫功能发生改变[3]。Caldwell等[4]将小鼠脾脏淋巴细胞置于2.5%低氧环境中培养时，发现T细胞成熟延缓，其分泌细胞因子的能力也发生改变。在研究肿瘤免疫时发现，肿瘤无氧区的T淋巴细胞浸润数量虽然没有明显变化，其功能却显著下降[5]。低氧和寒冷均可在一定程度上抑制大鼠脾脏T细胞的增殖[6]。急性高原肺水肿患者外周血中血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、VEGF、内皮素-1(ET-1)、免疫球蛋及中性粒细胞比例明显增高[7，8]。Phan等[9]研究发现低氧可导致T细胞增殖能力下降且细胞周期延迟。多数研究认为，低氧对血浆免疫球蛋白影响不大，因而B淋巴细胞功能不受明显影响[10]。

脾脏作为最大的外周免疫器官，不仅是成熟T、B淋巴细胞等免疫细胞定居的部位，也是产生特异性体液免疫和细胞免疫的场所[11]。在脾脏的免疫反应中，T细胞是最重要的免疫细胞之一，在机体的免疫应答中处于核心地位，在固有免疫、获得性免疫、移植免疫、自身免疫性疾病的发病、肿瘤免疫及超敏反应中都发挥着重要作用。T淋巴细胞在淋巴细胞中占相当比例，根据其功能特征和表面标志，可分为CD4+和CD8+两个亚群。CD4+T细胞主要分化为Th1、Th2和Th17三类效应细胞，分别分泌不同的细胞因子，发挥不同的免疫效应[14]。CD8+T细胞为细胞毒性T(CTL)细胞，是机体抗肿瘤效应中起关键作用的效应细胞[15]。它能释放多种细胞因子和酶，如IL-6、穿孔素、溶细胞素等、通过溶细胞作用直接杀伤肿瘤细胞。本研究结果显示海拔2 200 m和海拔4 200 m高原低氧暴露30 d后，小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞数均显著减少，其中，CD4+T细胞数较CD8+T细胞数下降水平高，整体下降趋势与大鼠实验基本相同[16]。提示高原低氧暴露可导致小鼠的细胞免疫功能降低。T细胞完全活化需要两个信号：第一信号由T细胞抗原受体和MHC/抗原肽结合提供，第二信号则由协同刺激受体与配体相互结合所介导。T细胞表面存在许多重要的共刺激分子，能够介导T细胞的增殖、活化以及效应功能的发挥。其中，CD28分子与抗原提呈细胞(APC)表面B7分子间相互作用是诱导T细胞活化的重要辅助信号[17]。根据是否表达CD28分子，可将T 细胞分为CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD28-、CD8+CD28-共4个亚群。CD4+CD28+T细胞包括大多数辅助性T 细胞，CD8+CD28+T细胞为效应性杀伤(又称细胞毒性)T细胞。本研究结果显示，海拔2 200 m和海拔4 200 m高原低氧暴露30 d后，小鼠脾脏CD4+CD28+细胞数明显降低，而CD8+CD28+细胞数无明显变化，提示高原低氧暴露使小鼠脾脏CD4+T细胞活化水平降低，而CD8+T细胞活化水平无明显变化，这也可能是由于低氧暴露过程中先降低后增加而恢复所致[12]。低氧条件下，小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的改变可能与低氧暴露后糖皮质激素、促肾上腺皮质激素以及前炎症因子显著增加有关[18，19]。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.010

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1002-266X(2016)47-0036-03

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