HPLC法测定秦艽及其不同配伍药对中两种环烯醚萜苷类成分含量研究

刘飞，马腾茂，王蓉，罗奎元，强宇靖，杨秀娟，高慧琴

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

HPLC法测定秦艽及其不同配伍药对中两种环烯醚萜苷类成分含量研究

刘飞，马腾茂，王蓉，罗奎元，强宇靖，杨秀娟，高慧琴

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

目的：建立HPLC法同时测定秦艽及其不同配伍药对（秦艽威灵仙、秦艽桑寄生、秦艽防己）水煎液中两种环烯醚萜苷类成分含量的方法。方法：采用Agilent A3000250×046 Pursuit 5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色谱柱；流动相为甲醇（A） -0.04%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～28 min，A 15%→23%；28～35 min，B 23%→35%；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；检测波长245 nm。结果：獐牙菜苦苷、龙胆苦苷分别在0.025 8 μg～1.032 0 μg、0.265 μg～10.60 μg内线性关系良好，平均加样回收率分别为99.67%（RSD=2.55%，n=6），101.36%（RSD=2.86%，n=6），与单味秦艽比较，三组药对中獐芽菜苦苷的含量均升高，尤以秦艽威灵仙药对升高明显；三组药对中龙胆苦苷含量亦发生了变化，其中秦艽威灵仙药对中龙胆苦苷含量升高，而秦艽桑寄生药对、秦艽防己药对中龙胆苦苷含量却降低，尤以秦艽桑寄生药对降低明显。结论：秦艽配伍用药后所含的有效成分含量发生了变化；本研究所建立的龙胆苦苷、獐牙菜苦苷含量测定方法简便、准确、重复性较好。

HPLC；秦艽；秦艽-威灵仙；秦艽-桑寄生；秦艽-防己；环烯醚萜苷；含量测定

秦艽味辛、苦，性平，归胃、肝、胆经，具有袪风除湿、通络止痛等功效，临床主要用于风湿痹证、筋脉拘挛、关节屈伸不利等，素有风寒湿三痹要药之称[1]。本研究在中医理论指导下，以性平祛风湿中药秦艽为基本药，分别配伍威灵仙、桑寄生、防己，组成平温相配(秦艽+威灵仙)、平平相配(秦艽+桑寄生)、平寒相配(秦艽+防己)的配伍关系，通过前期秦艽寒热不同配伍药对对类风湿性关节炎模型大鼠作用的观察，发现其作用强弱有别[2]。《中华人民共和国药典》2015年版(一部)标准对祛风湿中药秦艽中的龙胆苦苷进行定量测定，相关文献亦有关于单味秦艽中的龙胆苦苷、獐芽菜苦苷同时含量测定的方法[2～4]，但关于秦艽配伍药对中龙胆苦苷、獐芽菜苦苷同时含量测定方法的研究尚未见报道。本研究采用HPLC法测定单味秦艽及秦艽药对中的龙胆苦苷及獐芽菜苦苷的含量变化，为秦艽及其寒热不同配伍药对的祛风湿作用及化学成分的相关性研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 药材 实验所用药材均购自兰州惠仁堂药店，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李成义教授鉴定：秦艽为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.的干燥根，威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根及根茎，桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis(DC.)Danser的干燥带叶茎枝，防己为防己科植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore的干燥根。

1.2 仪器与试剂 Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；SK3300H型超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；BT125D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；102电热鼓风干燥箱(龙口市先科仪器公司)；500mLMYB型电子调温电热套(天津市中实验电炉有限公司)。獐芽菜苦苷对照品(批号 PY20150915GF)，龙胆苦苷对照品(批号PY20150908AT)，以上对照品纯度均为98%，均购自南京普怡生物科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯(德国默克公司)；水为超纯水；磷酸及其他试剂均为市售分析纯(广州化学试剂公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为A3000250×046 Pursuit 5 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A：甲醇；流动相B：0.04%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～28 min，A相15%→23%；28～35 min，B相23%→35%)；流速0.8 mL/min；柱温30℃；检测波长245 nm；进样量5 μL。

2.2 对照品溶液的配制 高浓度对照品溶液的制备：精密称取獐牙菜苦苷、龙胆苦苷对照品1.032 mg、10.60 mg分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别制成对照品高浓度溶液。低浓度对照品溶液的制备：分别精密量取獐牙菜苦苷、龙胆苦苷高浓度对照品溶液各1 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别制成对照品低浓度溶液。精密量取上述高浓度对照品溶液各1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得0.010 32 mg/mL獐牙菜苦苷、0.106 0mg/mL龙胆苦苷的混合对照品溶液，置4℃冰箱保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备 分别称取秦艽1 g，秦艽-威灵仙(质量比1∶1)2 g，秦艽-防己(质量比1∶1)2 g，秦艽-桑寄生(质量比1∶1)2 g。分别置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入十倍量纯水，回流加热提取60 min，稍冷后过滤于100 mL容量瓶中，药渣再加八倍量纯水，回流加热提取30 min，稍冷后过滤于原100 mL容量瓶中，加纯净水稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液5 μL进样分析。

2.4 阴性样品液的制备 分别称取威灵仙、防己、桑寄生药材各1 g，按2.3项下方法分别制成威灵仙、防己、桑寄生单煎阴性样品液。

图1 高效液相色谱图 (A：獐芽菜苦苷，B：龙胆苦苷)

2.5 系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品液各5 μL，在上述选定的色谱条件下分别进样测定，HPLC色谱图见图1。结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的保留时间分别在23.4 min、27.8 min，峰分离度良好，阴性样品无干扰。

2.6 线性关系 分别依次精密吸取2.2项下的高浓度对照品溶液各2.5 μL、5 μL、10 μL及低浓度对照品溶液各2.5 μL、5μL、10 μL、15 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量(μg)X为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，獐牙菜苦苷的回归方程为：Y=2 205.1X-27.099，(r= 0.999 7)，龙胆苦苷的回归方程为：Y=1 964.5X-169.25，(r=0.999 8)。结果表明獐牙菜苦苷在0.025 8 μg～1.032 0 μg、龙胆苦苷在0.265 μg～10.60 μg的含量范围内具有良好的线性关系。

2.7 精密度试验 分别精密吸取獐芽菜低浓度苦苷对照品溶液、龙胆苦苷低浓度对照品溶液各5 μL，连续进样6次，记录色谱图，测得獐芽菜苦苷、龙胆苦苷的峰面积RSD值分别为1.96%、2.06%，结果表明精密度良好。

2.8 重复性试验 称取秦艽1 g，平行6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，5 μL进样检测分析，煎液中獐芽菜苦苷、龙胆苦苷含量的RSD分别为2.16%、1.48%，表明实验重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、4、6、8、12 h进样测定，獐芽菜苦苷、龙胆苦苷峰面积RSD值分别为1.64%、1.40%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。2.10 加样回收率试验 见表1、表2。称取已知含量的同一批号秦艽样品6份，分别加入一定量的獐芽菜苦苷对照品、龙胆苦苷对照品，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样5 μL，记录色谱峰，计算加样回收率。

表1 獐芽菜苦苷加样回收率结果

表2 龙胆苦苷加样回收率结果

2.11 样品的测定 见表3。取4种样品(秦艽、秦艽-威灵仙、秦艽-防己、秦艽-桑寄生)按2.3项下方法平行制备3份供试品溶液，在上述色谱条件下进样5 μL，测得獐芽菜苦苷、龙胆苦苷峰面积并代人回归方程计算獐芽菜苦苷、龙胆苦苷的含量。

表3 不同配伍样品中獐芽菜苦苷、龙胆苦苷含量的测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 分别取獐芽菜苦苷对照品、龙胆苦苷对照品适量，在190 nm～400 nm波长范围内进行紫外光谱波长扫描，结果显示獐芽菜苦苷、龙胆苦苷的最大吸收波长分别为236 nm、270 nm，综合考虑，在245 nm波长处，獐牙菜苦苷、龙但苦苷的灵敏度均较高，杂质干扰少，故选择245 nm为检测波长。

3.2 色谱条件的选择 在参考文献的基础上[5～9]，根据指标性成分的理化性质和色谱行为，我们分别对柱温，流动相，进样量等条件进行了摸索。比较了多种柱温，优选出柱温为30℃；比较了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水多种洗脱系统，分别进行等度与梯度的洗脱方式，结果表明，采用甲醇-磷酸水系统进行梯度洗脱，各成分的分离效果较好；比较了多种进样量，结果显示5 μL较合理。

3.3 样品的制备方法 本实验结合临床给药模式，采用经典而传统的水煎煮样品制备方法，煎煮后又采用三种处理方法，第一种方法，直接用纯净水定容至刻度；第二种方法，浓缩到定量，精密移取少量用甲醇定容至刻度；第三种方法，浓缩至干，加甲醇定容至刻度，结果显示，第一种处理方法得到的色谱峰分离度良好，有效成分含量高，故选择第一种方法。

3.4 含量测定的讨论 本实验建立了HPLC法同时测定秦艽及其配伍药对中的两种有效成分，方法简便、有效，与单味秦艽相比，三组药对中獐芽菜苦苷的含量均升高，尤以秦艽威灵仙药对升高明显；三组药对中龙胆苦苷含量亦发生了变化，其中秦艽威灵仙药对中龙胆苦苷含量升高，而秦艽桑寄生药对、秦艽防己药对中龙胆苦苷含量却降低，尤以秦艽桑寄生药对降低明显。含量测定结果显示，秦艽配伍用药后，有效成分含量确实有所改变，这种有效成分含量的改变，与其临床药效之间的关联性还需进一步研究。

[1]黄芳.中药学[M].北京：中国医药科技出版社，2012.

[2]高慧琴，吴国泰，孙少伯，等.秦艽不同配伍对风湿痹证模型大鼠血清炎症因子水平的影响[J].中医杂志，2013，54(9)：785-788.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].1部.北京：中国医药科技出版社，2015：270-271.

[4]吴靳荣，吴立宏，赵志礼，等.中药秦艽和习用品中5种环烯醚萜类成分的HPLC含量测定[J].中国中药杂志，2014，39(4)：715-720.

[5]李荣娇，杨凤仙，袁绿益，等.HPLC法测定西藏秦艽花与川西秦艽花中7种成分的量[J].中草药，2015，46 (8)：1227-1230.

[6]董琦，吉文鹤，肖远灿，等.HPLC法同时测定藏药岷县龙胆中4种有效成分的含量[J].天然产物研究与开发，2014，26(4)：561-563.

[7]徐敏，张振秋.HPLC法同时测定青叶胆中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的含量[J].辽宁中医杂志，2013，40(1)：145-147.

[8]张兴旺，陶燕铎，梅丽娟，等.HPLC测定7种龙胆科植物花中龙胆苦苷与獐牙菜苦苷的含量[J].中国野生植物资源，2010，29(2)：38-40.

[9]徐康平，申健，李福双，等.多波长HPLC同时测定3种獐牙菜属植物中6种活性成分[J].中国中药杂志，2009，34(11)：1384-1389.

（责任编辑：冯天保，郑锋玲）

Simultaneous Content Determination of 2 kinds of Iridoid Glycosides in Gentiana macrophylla Pall and Its Different Double-Drugs Compatibility with HPLC

LIU Fei，MA Tengmao，WANG Rong，LUO Kuiyuan，QIANG Yujing，YANG Xiujuan，GAO Huiqin

Objective：To establish HPLC(high performance liquid chromatography)method for simultaneous determination of 2 kinds of Iridoid glycosides’composition in Gentiana macrophylla Pall and its different double-drugs compatibility(Gentiana macrophylla Pall-Clematis chinensis Osbeck，Gentiana macrophylla Pall-Herba taxilli， Gentiana macrophylla Pall-Radix stephaniae tetrandrae)decoction.Methods：Adopted chromatograph column Agilent A3000250×046 Pursuit 5 C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，mobile phase was methanol(A)-0.04%phosphoric acid solution(B)，gradient elution：0～28 min，A 15%→23%；28～35 min，B 23%→35%；flow rate was 0.8 mL/min；column temperature was 30℃；detection wavelength was 245 nm.Results：Swertiamarin and gentiopicroside were in a good linear relationship within 0.025 8 μg～1.032 0 μg，0.265μg～10.60 μg separately.Average recovery rate was 99.67%(RSD=2.55%，n=6)，101.36%(RSD=2.86%，n=6)separately. Compared with single Gentiana macrophylla Pall，contents of swertiamarin in the three drug pairs were increased，especially in drug pair Gentiana macrophylla Pall-Clematis chinensis Osbeck.Contents of Gentiopicroside in the three groups were changed.Contents of swertiamarin in drug pair Gentiana macrophylla Pall-Clematis chinensis Osbeck was increased，but was decreased in drug pair Gentiana macrophylla Pall- Radix Stephaniae Tetrandrae，especially in drug pair Gentiana macrophylla Pall-Herba Taxilli.Conclusion：Content of active components in Gentiana macrophylla Pall was changed after compatibility medication.Determination method of Gentiopicroside and Swertiamarin that established in this research is simple，accurate and has good repeatability.

High performance liquid chromatography(HPLC)；Gentiana macrophylla Pall；Gentiana macrophylla Pall -Clematis chinensis Osbeck； Gentiana macrophylla Pall- Herba Taxilli； Gentiana macrophylla Pall-Radix Stephaniae Tetrandrae；Iridoid glycosides；Content determination

R284

A

0256-7415（2016）12-0217-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.091

2016-07-06

国家自然科学基金地区基金项目（81360648）

刘飞（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：中药及复方应用的研究。

高慧琴，E-mail：ghq@gszy.edu.cn。