石河子垦区盐碱地土壤嗜(耐)盐菌的分离与鉴定

赵 路，李木子，冉茂双，雷勇辉，孙燕飞*(.石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 83003； .石河子大学 农学院，新疆 石河子 83003)

石河子垦区盐碱地土壤嗜(耐)盐菌的分离与鉴定

赵 路1，李木子1，冉茂双1，雷勇辉2，孙燕飞1*
(1.石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832003； 2.石河子大学 农学院，新疆 石河子 832003)

为了开发利用石河子垦区盐碱地的嗜(耐)盐菌资源，从该区盐碱地土样及池底泥样中分离筛选嗜(耐)盐菌，并从形态特征、生理生化特性、16S rRNA序列3个方面进行分析鉴定。结果表明，从土样及泥样中共分离获得6 株嗜(耐)盐菌。其中，SYJ-7是球菌，为革兰氏阳性；其余5株是杆菌，均为革兰氏阴性。在耐盐、碱试验中，6株菌均在NaCl质量浓度≤200 g/L、pH值≤9条件下生长，6株菌均为中度嗜盐菌。SYJ-9耐盐、碱程度最高，可耐受的最高NaCl质量浓度为280 g/L，最高pH值为13。在功能酶筛选试验中，SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9产淀粉酶，SYJ-7产纤维素酶，SYJ-9产蛋白酶。16S rRNA序列分析表明，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5属于玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusmanasiensis)，SYJ-7属于玫瑰色盐水球菌(Salinicoccusroseus)，SYJ-9属于盐芽孢杆菌属(Halobacillus)。其中，SYJ-9可能为新种。

石河子垦区； 嗜(耐)盐菌； 分离纯化； 菌种鉴定

新疆石河子垦区地处天山北麓中段(84°58′～86°30′E、43°27′～45°20′N)[1]。在古生代以前，该地区地表风化壳及其析出的盐类随水由陆台向地槽迁移，形成现在山系的含盐底层(包括盐山、盐岩、盐矿和石膏矿等)，在蒸发量大、降水稀少的高温干旱气候作用下，该区四周环绕的山地岩石和成土母质中的钠盐土通过微弱的季节性淋溶或地下水升降及潜水蒸发，在低平部位形成大面积的盐土和碱土[2]。这种高盐、高碱的土壤中蕴藏着丰富多样的嗜(耐)盐菌类群。嗜盐菌是只在含盐的环境才能生长的微生物，一般生长在盐湖、盐碱湖、死海、盐场和海洋中[3]。根据对盐的耐受程度和范围，将盐生生物分为6类：非嗜盐菌，其最适生长盐(NaCl)浓度<0.2 mol/L，主要是淡水微生物；轻度嗜盐菌，其最适生长盐浓度为0.2～0.5 mol/L，多数海洋微生物属于这个类群；中度嗜盐菌，其最适生长盐浓度为0.5～2.5 mol/L；边缘极端嗜盐菌，其最适生长盐浓度在1.5～4.0 mol/L；极端嗜盐菌，其最适生长盐浓度为2.5～5.2 mol /L；耐盐菌，其生长对NaCl浓度没有要求，其中对盐分的耐受浓度超过2.5 mol/L的称为极端耐盐菌[4]。中度嗜盐菌基本上是真细菌，极端嗜盐菌属于古细菌[5]。需要指出的是，一个中度嗜盐菌菌株，其耐受盐浓度范围会随着环境条件(如温度、营养状况等)的改变而不同。另外，也有人倾向于将中度嗜盐菌的最佳生长NaCl质量浓度定为50～200 g/L[6]。

由于嗜(耐)盐菌具有独特的环境适应模式和特殊的生理机制，在高盐生态系统中发挥着重要作用，是极为宝贵的极端微生物资源，具有重要的研究和开发利用价值[7]。大量研究表明，嗜(耐)盐菌既可用于环境治理，如高盐废水的处理[8-12]，也可用于盐碱土的修复[13-15]。张桂玲[13]在中性偏碱的棉田中施用中度嗜盐菌，发现短时间内土壤中细菌数量增加，真菌数量随土壤pH值降低而增多。刘彩霞[14]从新疆、江苏地区盐碱土样品中分离筛选获得耐盐碱分解秸秆和产胞外多糖的细菌，该细菌与外源有机物相互作用可改善植物根际环境、增加土壤酶活性、提高保水性能、促进盐碱土团聚体的形成，从而改良盐碱地土壤并提高植物的耐盐性。Rao等[15]研究发现，通过耐盐碱微生物作用改善植物根际环境，可减轻盐分对作物生长的抑制作用，并改良盐碱地。新疆蕴含有丰富的嗜(耐)盐菌资源，目前，已经从新疆众多地区分离鉴定了很多嗜(耐)盐菌，顾晓颖等[16]从巴里坤湖和玛纳斯湖水样共分离得到51株嗜盐菌；王建明等[17]从塔里木盆地荒漠盐碱生境中分离到120株嗜(耐)盐碱细菌，其中33株为嗜盐碱细菌；迪丽拜尔等[18]从新疆艾丁湖及邻近地区获得嗜盐菌61株，其中3株为新种；刘会强等[19]从新疆达坂城盐湖中分离得到17株中度嗜盐菌。但对于石河子垦区盐碱地土壤嗜(耐)盐菌的分离、鉴定研究罕有报道。为此，从石河子垦区盐碱地土样及附近即将干涸的池底泥样中分离筛选嗜(耐)盐菌，并对其进行鉴定，以期为盐碱地土壤的微生物修复及高盐废水的治理提供菌种资源。

1 材料和方法

1.1 样品采集

取石河子垦区盐碱地土样及附近即将干涸的池底泥样置于塑料袋中运回实验室，用于菌株培养分析。

1.2 培养基

基础培养基：酸性酪蛋白5.0 g/L、柠檬酸钠3.0 g/L 、酵母浸粉10.0 g/L、KCl 2.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、NaCl 150 g/L、琼脂20.0 g/L，调节pH值为7.5。

Gibbions改良培养基：酸性酪蛋白5.0 g/L、柠檬酸钠3.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L、KCl 2.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、NaCl 200 g/L、琼脂20.0 g/L，调节pH值为7.5。

淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶筛选培养基见文献[4,20]。

1.3 菌株的分离

采用Gibbions改良培养基，以微生物能够在200 g/L NaCl分离平板上生长作为嗜(耐)盐菌的分离依据，通过稀释涂布法和画线法分离纯化嗜(耐)盐菌。待菌落长出后，根据菌落大小、形态、颜色不同进行初步分类，反复划线分离，纯化菌株冷藏保存。

1.4 菌株形态和生理生化特性分析

1.4.1 菌株形态分析 取少量菌体，接种在Gibbions改良培养基平板上划线培养。于37 ℃培养箱内培养3～4 d，记录平板表面单菌落特征(形态、大小、颜色、透明程度、边缘和凸起等)。并经2%乙酸固定脱盐后采用常规革兰氏染色法在光镜下观察菌体形态。

1.4.2 菌株生理生化特性分析 对菌落进行革兰氏染色，并进行产酶试验，淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶初筛方法见文献[21-22]。

耐盐性试验：在基础培养基中，加入NaCl，使其质量浓度分别为100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300 g/L。在含有不同质量浓度NaCl的培养基平板上接种菌株，37 ℃培养7～15 d，观察并记载生长情况。

耐碱性试验：将基础培养基(NaCl加入量为150 g/L)的初始pH值分别调至7、8、9、10、11、12、13，然后接种菌种，37 ℃培养7～15 d，观察并记载生长情况。

1.5 基于16S rRNA序列的系统发育分析

采用CTAB法提取细菌DNA，菌株16S rRNA基因片段的PCR扩增引物采用细菌通用引物27F和1492R。PCR扩增体系为25 μL：10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、MgCl21.5 μL、27F 1 μL、1492R 1 μL、DNA模板 1 μL、Taq酶 0.25 μL、ddH2O 15.75 μL。PCR程序为：94 ℃ 5 min(预变性)；95 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 75 s，34个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物送测序公司(上海生工)测序。将测得的16S rRNA序列在GenBank中进行BLAST比对，并采用MEGA 6.0软件中的Clustal W删除序列匹配排列中出现的插入和缺失。通过序列数据计算矩阵距离，然后使用Neighbor-joining方法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 嗜(耐)盐菌的菌株形态及生理生化特性

根据分离平板NaCl质量浓度以及菌落形态差异去掉部分冗余菌株，最终从14个分离物中确定了6个表型特征不同的菌株，对6株嗜(耐)盐菌的菌落形态、菌体形态及一些生理生化特性研究(表1、图1、表2)发现:SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-9均为杆菌，革兰氏染色均为阴性，但SYJ-9菌体长宽比较小，菌体形状呈短杆状；SYJ-7为球菌，革兰氏染色为阳性，菌落为橙红色，表面凸起；SYJ-9菌落形态与SYJ-7相似，但SYJ-9菌落颜色为白色，表面微凸；其余4株菌的菌落形态相似。单从菌落及菌体形态上看，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5可能为同一类，SYJ-7为一类，SYJ-9为一类。6株嗜(耐)盐菌的产酶结果(表2)表明，4株 可以产淀粉酶，分别为SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9；6株均不产木聚糖酶； 1株可以产纤维素酶，为SYJ-7；1株可以产纤蛋白酶，为SYJ-9。

表1 6株嗜(耐)盐菌的菌落形态

A、C、E、G、I、K分别为SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9菌株的菌体形态； B、D、F、H、J、L分别为SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9菌株的菌落形态

项目SYJ-1SYJ-2SYJ-3SYJ-5SYJ-7SYJ-9项目SYJ-1SYJ-2SYJ-3SYJ-5SYJ-7SYJ-9菌体形态长杆状长杆状长杆状长杆状球形短杆状木聚糖酶------革兰氏染色----+-纤维素酶----+-淀粉酶--++++蛋白酶-----+

注： +表示阳性；-表示阴性。

2.2 嗜(耐)盐菌的耐盐性生长状况

耐盐试验结果(表3)表明，6株嗜(耐)盐菌均能在含≤200 g/L NaCl的培养基中生长，SYJ-1与SYJ-2可耐受的最高NaCl质量浓度为200 g/L；SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7可耐受的最高NaCl质量浓度为220 g/L；SYJ-9可耐受的最高NaCl质量浓度为280 g/L。其中，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3在含≤140 g/L NaCl的培养基中均能够旺盛生长，SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9在含≤180 g/L NaCl的培养基中均能够旺盛生长。综上，SYJ-9的耐盐性最高，其次是SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7，SYJ-1、SYJ-2的耐盐性较低。由于SYJ-1能在含≤140 g/L NaCl的环境中旺盛生长，SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7均能在含≤180 g/L NaCl的环境中良好生长，SYJ-9能在含≤200 g/L NaCl的环境中良好生长，各菌株超过上述NaCl质量浓度则生长不佳，甚至不能生长。因此，6株菌不属于边缘极端嗜盐菌和极端嗜盐菌，可初步鉴定为中度嗜盐菌，且其生长的最佳盐浓度可能与培养温度、营养状况有关[6]。

表3 6株嗜(耐)盐菌的耐盐性生长状况

注：+++表示生长旺盛；++表示生长良好；+表示能生长；-表示不能生长。下同。

2.3 嗜(耐)盐菌的耐碱性生长状况

耐碱试验结果(表4)表明，SYJ-1可耐受的最高pH值为9，SYJ-2可耐受的最高pH值为10，SYJ-3与SYJ-5可耐受的最高pH值为11，SYJ-7可耐受的最高pH值为12，SYJ-9可耐受的最高pH值为13。其中，SYJ-7在pH值≤10的培养基上均能够旺盛生长，SYJ-9在pH值≤11的培养基上均能够旺盛生长，其他菌株总体上不能够达到旺盛生长的状态，最多只是良好生长。综上，SYJ-9的耐碱性最高，其次为SYJ-7，SYJ-1的耐碱性最低。

表4 6株嗜(耐)盐菌的耐碱性生长状况

2.4 基于16S rRNA序列的嗜(耐)盐菌的系统发育分析

研究表明，当菌株16S rRNA序列同源性≥97%时可以认为属于一个属，当序列同源性≥98%时则可以认为属于一个种[23]。对6株嗜(耐)盐菌的16S rRNA序列进行BLAST比对并构建系统发育进化树(图2)发现，SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5的16S rRNA序列与玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusmanasiensis)的16S rRNA序列相似性为99%～100%，因此SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5属于玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusmanasiensis)；SYJ-7的16S rRNA序列与玫瑰色盐水球菌(Salinicoccusroseus)的16S rRNA序列有98%的相似性，因此初步判断SYJ-7属于玫瑰色盐水球菌(Salinicoccusroseus)；SYJ-9的16S rRNA序列与盐芽孢杆菌(Halobacillus)的16S rRNA序列有97%的相似性，故判断其属于盐芽孢杆菌属(Halobacillus)，具体种还需进一步鉴定，暂且命名为Halobacillussp.SYJ-9。

3 结论与讨论

从石河子垦区盐碱地土样及泥样中分离出6株嗜(耐)盐细菌，分别命名为SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5、SYJ-7、SYJ-9。SYJ-1、SYJ-2、SYJ-3、SYJ-5菌落形态及菌体形态相似，但生理生化特性存在差异。其中，SYJ-1、SYJ-2的耐盐及耐碱性较SYJ-3、SYJ-5低，且SYJ-3、SYJ-5为产淀粉酶菌株。经16S rRNA序列比对及系统发育分析发现，SYJ-1、 SYJ-2、 SYJ-3、SYJ-5属于玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillusmanasiensis)，SYJ-1、SYJ-2与SYJ-3、SYJ-5可能分属2个不同亚种，还需做进一步鉴定。SYJ-7为革兰氏阳性菌且菌体为球状，能产淀粉酶和纤维素酶，属于玫瑰色盐水球菌(Salinicoccusroseus)。SYJ-9为革兰氏阴性菌且菌体为短杆状，能产淀粉酶和蛋白酶，属于盐芽孢杆菌属(Halobacillus)，暂且命名为Halobacillussp.SYJ-9。李新等[24]研究表明，Halobacillussp.LY6属于高产蛋白酶中度嗜盐菌，本研究中的Halobacillussp.SYJ-9蛋白酶活性强度还需进一步测定。

图2 基于16S rRNA序列构建的菌株系统发育进化树

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Isolation and Identification of Halophilic(Halotolerant) Microorganisms from Saline-alkaline Soils in Shihezi

ZHAO Lu1,LI Muzi1,RAN Maoshuang1,LEI Yonghui2,SUN Yanfei1*
(1.College of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

In order to explore and utilize the resources of halophilic(halotolerant) microorganisms from saline-alkaline soils in Shihezi,the saline-alkaline soil mud samples were separated and purified in Shihezi,and the strains were identified through the morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,the 16S rRNA sequences.The experiment result showed that 6 halophilic(halotolerant) strains were obtained,SYJ-7 was coccus,Gram positive;the rest of the 5 strains were bacillus,Gram negative.Six strains could grow under the conditions of NaCl concentration≥200 g/L and pH value≥9,belonged to moderate halophytic bacteria.Among them,SYJ-9 had high levels of salt and alkali resistance,with the highest pH value of 13 and NaCl concentration of 280 g/L.SYJ-3,SYJ-5,SYJ-7,SYJ-9 produced amylase,SYJ-7 produced cellulose enzyme,SYJ-9 produced protease.16S rRNA sequences analysis showed that SYJ-1,SYJ-2,SYJ-3 and SYJ-5 belonged toOceanobacillusmanasiensis,SYJ-7 belonged toSalinicoccusroseus,SYJ-9 belonged toHalobacillus.SYJ-9 may be the potential novel species.

reclamation area of Shihezi; halophilic(halotolerant) microorganisms; separation and purification; identification of strains

2015-12-10

石河子大学第13期SRP项目(SRP2015092)；石河子大学高层次人才启动项目(RCZX201427)

赵 路(1995-)，女，河南鹤壁人，在读本科生，研究方向：微生物学。E-mail:1270541716@qq.com

*通讯作者：孙燕飞(1976-)，女，新疆石河子人，副教授，博士，主要从事微生物学研究。E-mail：syfei@shzu.edu.cn

S154.3

A

1004-3268(2016)06-0051-05