玻璃化冷冻技术在人类胚胎中的应用价值

吴成亮　巢时斌▲　曾敬人　苏占营　辜　敏.江西省九江市妇幼保健院辅助生殖科，江西九江　33000；.江西省九江市妇幼保健院信息科，江西九江　33000



玻璃化冷冻技术在人类胚胎中的应用价值

吴成亮1巢时斌1▲曾敬人2苏占营1辜敏1
1.江西省九江市妇幼保健院辅助生殖科，江西九江332000；2.江西省九江市妇幼保健院信息科，江西九江332000

［摘要］目的探讨玻璃化冷冻技术在人类胚胎中的应用价值。方法选择2014年3月～2016年2月在我院生殖中心做试管婴儿的264例不孕不育患者，经患者知情同意后，将实施体外受精-胚胎移植术患者卵裂期胚胎和囊胚符合冷冻标准的胚胎进行玻璃化冷冻保存。根据患者情况解冻胚胎移植，观察胚胎复苏后的临床妊娠效果。结果玻璃化冷冻74个周期，解冻胚胎149枚，解冻后存活胚胎147枚，存活率98.66%；种植胚胎56枚，种植率38.10%；临床妊娠42例（单胎27例，双胎14例，宫外孕1例），临床妊娠率为56.76%。结论玻璃化冷冻法是人类胚胎保存的优选方法，获得了理想的复苏率、种植率和妊娠率。

［关键词］试管婴儿；玻璃化冷冻技术；人类胚胎；应用价值

▲通讯作者

从1978年世界第一例“试管婴儿”Louise Brown出生至今，全世界已经有超过500多万例通过人类辅助生殖技术（human assisted reproductive technology，ART）诞生的婴儿。而我国人类辅助生殖技术经过将近40年的长足发展，现如今人工促排、取卵与实验室的体外受精、胚胎培养技术及胚胎的冷冻、移植技术都已经达到了国际先进水平［1］。在IVF周期中，我们通常将新鲜移植后的多余胚胎进行囊胚培养或者冷冻保存。胚胎的冷冻已经成为人类辅助生殖技术中不可缺少的重要组成部分，可降低多胎率，有效预防卵巢过度刺激征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）。而近年来出现的玻璃化冷冻技术与传统的程序化冷冻相比，具有不需要大型设备、液氮用量少、耗时少、成本低、节省人力、操作简单、应用范围广、复苏率高等优点［2］。可以说，玻璃化冷冻法是一项简单、快速、经济、有效的冷冻方法，已经被越来越多的生殖中心所采用。我院生殖中心于2014年3月～2016年2月行试管婴儿（in Vitro fertilization，IVF）264个周期，本文就玻璃化冷冻技术在辅助生殖中的应用加以论述，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2014年3月～2016年2月期间因不孕不育在本中心行常规体外受精-胚胎移植（IVF-ET）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）治疗的264例患者，其中200例进行玻璃化冷冻胚胎814枚，期间对74例患者的149枚胚胎进行玻璃化解冻复苏移植。

1.2材料

日本加藤（KITAZATO）公司玻璃化冷冻、解冻试剂套盒，冷冻试剂包括平衡液（equilibration solution，ES）、冷冻液（vitrification solution，VS）；解冻试剂含有解冻液（thawing solution，TS）、稀释液（diluent solufion，DS）、洗液1（washing solution l，WS1）和洗液2（washing solution 2，WS2），开放性冷冻载杆（cryotop），液氮。

1.3冷冻胚胎的标准

参照文献［3］的卵裂期胚胎分级方法并结合本中心实际工作将D3胚胎分为4级：Ⅰ级胚胎卵裂球均匀，胚胎无碎片或有少量碎片（＜5%）；Ⅱ级胚胎卵裂球均匀，胚胎碎片＜20%；Ⅲ级胚胎卵裂球均匀或不均匀，胚胎碎片＜50%；Ⅳ级胚胎卵裂球均匀或不均匀，胚胎碎片≥50%。中心规定Ⅰ～Ⅲ级胚胎予以冷冻，Ⅳ级胚胎不予冷冻。囊胚冷冻标准为第5、6天发育到4BC 或4BC以上的胚胎方可进行玻璃化冷冻。

1.4玻璃化冷冻

在室温下（24℃）将1～2个胚胎移入平衡液中（equilibration solution，ES），预平衡6～7 min（卵裂期胚胎）/8～10 min（囊胚）后，再将ES中的胚胎移入玻璃化冷冻液（vitrification solution，VS），充分混匀后在60 s以内将胚胎迅速放置冷冻载杆（cryotop）顶端标记位置，并将载杆投入液氮装管保存。

1.5玻璃化解冻

把冷冻载杆（cryotop）从液氮中取出，将顶端迅速放入37℃预热的解冻液（thawing solution，TS）中60 s，再将解冻后的胚胎依次移入稀释液（diluent solufion，DS）、洗液1（washing solution l，WS1）和洗液2（washing solution 2，WS2）中，时间分别控制在3、5、5 min，之后将胚胎移入G2（vitrilife）胚胎培养液，再放入37℃、6%CO2培养箱内培养2 h，准备移植。

1.6复苏胚胎后的观察

卵裂球存活：胞质均匀，有光泽，完整的细胞膜；胚胎存活：复苏后卵裂球存活＞50%以上，有光泽，均一，有立体感。

1.7胚胎移植

对于月经正常、有规律排卵的患者采用自然周期，B超检测卵泡大小及子宫内膜厚度，结合促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）值确定排卵时间，肌注黄体酮（广州白云山明兴制药有限公司，国药准字：H44020229，规格：20 mg/支）40 mg，1次/d，3～5 d后移植冻融胚胎；对于月经不正常、排卵不规律、多囊卵巢综合征（PCOS）及黄体功能不全的患者采用人工周期，自月经来潮第3天开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，Delpharm Lille SAS，国药准字J20080036，规格：21片/盒）递增法，当内膜厚度≥8 mm时开始肌注黄体酮，3～5 d后移植冻融胚胎。胚胎移植后14 d，尿妊娠试验阳性，血HCG升高（≥10 mIU/mL）为生化妊娠；胚胎移植后4～5 周B超下显示有孕囊及胎心血管搏动，确定临床妊娠。

2　结果

选择2014年3月～2016年2月264例辅助生殖周期中有200例周期进行了玻璃化冷冻，冷冻率为75.76%（200/264）。其中解冻周期为74例，解冻胚胎149枚，解冻后有147枚胚胎存活，存活率为98.66% （147/149）；每周期平均移植冻融胚胎1.99枚（147/ 74）；147枚存活胚胎中有56枚胚胎种植，种植率为38.10%（56/147）；临床妊娠42例（单胎27例，双胎14例，宫外孕1例），临床妊娠率为56.76%（42/74）。

3　讨论

随着辅助生殖技术日新月异的发展，胚胎冷冻技术在辅助生殖中显得越来越重要。自Mukaida等［4］于1998年首次报道应用玻璃化冷冻人类卵裂期胚胎成功妊娠以来，玻璃化冷冻技术在全世界生殖中心迅速被推广应用。由王俊霞等［5］报道的中国首例玻璃化冷冻胚胎顺利分娩于2004年。玻璃化冷冻的原理：在一定的降温速率下，利用高浓度、极其黏稠的冷冻保护剂溶液将液态直接冻结为一种黏稠的、无结构的玻璃状态或者无冰晶结构的固态。这种玻璃状态由于内部没有形成冰晶，能保持其溶液状态的分子和离子分布，在冷冻和解冻的过程中冷冻液也不会在液态和晶体形态之间来回转换，从而避免了冰晶对细胞的物理化学损伤，可望获得更好的冷冻效果［6］。

本篇报道74例冷冻周期解冻149枚胚胎，解冻后存活147枚胚胎，存活率为98.66%；其中有56枚胚胎种植，种植率为38.10%；临床妊娠42例（单胎27例，双胎14例，宫外孕1例），临床妊娠率为56.76%。解冻后胚胎存活率、胚胎种植率和临床妊娠率均高于国内［7］及国外［8］文献报道。与我们中心实验人员在运行前期进行了大量的鼠胚试验、已能够熟练掌握胚胎的玻璃化冷冻解冻技术有关；同时中心应用日本加藤（KITAZATO）公司玻璃化冷冻、解冻试剂套盒及cryotop冷冻载杆，试剂的质量稳定，cryotop载杆操作起来比较方便。其中应用的cryotop最小容量法，Kuwayama［9］认为是一种非常有效的保存人类卵子和胚胎的方法。

玻璃化冷冻技术现已普遍应用于辅助生殖领域，技术不断在更新，然而冷冻效果可受多方面影响。首先玻璃化冷冻技术对操作人员要求高，因为玻璃化冷冻需要极短的操作时间及更加熟练的操作技术，所以对操作人员进行严格的训练和考核，人员考核通过并且确定掌握该技术后方能进入临床实际工作。其次，玻璃化冷冻效果受冷冻速率的影响，这也是玻璃化冷冻的关键步骤。胚胎从室温快速降至-196℃所需要的时间称为冷冻速率，冷冻过程中掌握好冷冻速率不仅可以减轻胚胎的低温损伤，而且还可降低高浓度冷冻保护液的毒性作用［10］。第三，冷冻保护剂，是指所有在冷冻和解冻过程中能够保护细胞、预防和减轻冷冻损伤的化学成分。但是玻璃化保护剂对细胞有毒性，保护剂的浓度越高，对细胞的毒性越强，甚至致畸。一旦浓度太高，将对所要冷冻的细胞或组织造成重度损伤，使其在生物保存中无法应用［11，12］。冷冻保护剂按生物化学特征可分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂两大类。渗透性冷冻保护剂又称细胞内冷冻保护剂，有乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、丙三醇（甘油）、二甲基亚砜（DMSO）等。这些有机物具有良好的水溶性，相对分子量小，多在63～97，能自由穿透细胞膜，迅速进入细胞内，细胞毒性弱，能够降低冰点，减少或者避免冰晶的形成。非渗透性冷冻保护剂又称细胞外冷冻保护剂，因分子量大，不能穿过细胞膜，加入细胞外液后，将产生细胞膜内外的渗透压差异，水分将从细胞内流入细胞外。细胞因水分被抽出而发生皱缩，细胞内水分减少，渗透压增加，冰晶形成受到抑制。非渗透性冷冻保护剂还有一个重要作用：复温解冻，预防细胞发生渗透性休克。非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、棉籽糖、葡萄糖、果糖等，目前玻璃化冷冻中普遍使用的是蔗糖［13］。第四，冷冻载体，玻璃化冷冻采用的载体包括开放载体和封闭载体。开放性载体降温速度快，方便胚胎实现玻璃化，但存在污染风险。然而到目前为止，还没有文献报道由于液氮引起人类疾病传播的案例［14］。更何况在平常的工作中，对于病毒携带者的胚胎我们是单独液氮罐保存的。封闭式载体虽然杜绝了污染风险，但操作时间增加，对技术人员的要求更高。其中大多数载体价格偏高。目前生殖领域多种载体并存的原因就是由于还没有找到一种操作时间短、既安全又便宜的载体，也限制了玻璃化技术的应用。

总之，玻璃化冷冻设备要求低、节省人力、应用范围广、复苏率存活高，已成为人类辅助生殖技术中的一项成熟、有效、实用的衍生技术。同时，由于高浓度的冷冻保护剂的使用，我们又会担心玻璃化冷冻的安全性［15］。虽然近年来国内出生的冻融胚胎移植的婴儿明显增多，还没有出生缺陷增加的报道，但是玻璃化冷冻技术应用于人类胚胎的时间毕竟比较短，随访数据偏少，因此，我们仍需长期对患者随访跟踪，以确保玻璃化冷冻技术广泛使用于人类胚胎的同时保证子代安全性。

［参考文献］

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［2］Wong JY，Wong AY. Phasing-in of vitrification into routine practice：Why，how，and what［J］. Hong Kong Med，2011，17（2）：119-126.

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［14］王杰，周从容.辅助生殖技术中胚胎冷冻技术的研究进展［J］.医药前沿，2014，10（4）：287-288.

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Application value of vitrification technique in human embryos

WU Chengliang1CHAO Shibin1ZENG Jingren2SU Zhanying1GU Min1
1.Department of Assisted Reproduction，Jiujiang Maternal and Child Care Center in Jiangxi Province，Jiujiang 332000，China；2.Department of Information，Jiujiang Maternal and Child Care Center in Jiangxi Province，Jiujiang 332000，China

［Abstract］Objective To explore the application value of vitrification technique in human embryos. Methods After obtaining the informed consent of 264 infertile patients who tried to have test tube babies in the reproductive center of our hospital from March 2014 to February 2016，vitrification technique was used to preserve the cleavage stage embryos and the embryos meeting the blastaea freezing standards of the patients having received external fertilization-embryo transplantation. The embryo was unfreezed and transplanted according to the patient situation and the clinical pregnancy effect after embryo recovery was observed. Results After 74 periods of vitrification，149 embryos were unfreezed，of which 147 embryos survived，with the survival rate of 98.66%，56 embryos were implanted，with the implant rate of 38.10%，and 42 cases of clinical pregnancy were achieved（27 cases of single birth，14 cases of twins and 1 case of ectopic pregnancy），with the clinical pregnancy rate of 56.76%. Conclusion Vitrification is a preferred method of preserving human embryos as it obtains the desired recovery rate，implantation rate and pregnancy rate.

［Key words］Test tube baby；Vitrification techniaue；Human embryos；Application value

［中图分类号］R318.52

［文献标识码］B

［文章编号］1673-9701（2016）10-0099-03

［基金项目］江西省卫生厅科技计划（20143059）

收稿日期：（2016-03-10）