广藿香精油抗氧化活性的研究

张丽敏，姜 涛

(江苏省肿瘤医院 药剂科，江苏 南京 210008)



广藿香精油抗氧化活性的研究

张丽敏，姜 涛*

(江苏省肿瘤医院 药剂科，江苏 南京 210008)

广藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.] ，常用的中药材之一, 含有丰富的挥发油, 药理活性清楚,但广藿香精油的抗氧化活性鲜有报道。本文以广藿香精油为原料，对其清除羟自由基的能力、清除超氧阴离子活性、还原能力、总抗氧化能力及抗脂质过氧化活性进行评价，为深入研究广藿香精油的抗氧化活性提供实验依据。

广藿香精油；抗氧化活性；研究

广藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.]为唇形科刺蕊草属植物, 分布于广东、广西、海南、云南和台湾等省区, 在广东省的广州郊区、肇庆和湛江等地有着丰富的自然资源。虽然广藿香是常用的中药材之一, 含有丰富的挥发油, 具香气,但广藿香精油的抗氧化活性鲜有报道。

本文以广藿香精油为原料，采用比色法研究其体外抗氧化作用，对其清除羟自由基的能力、清除超氧阴离子活性、还原能力、总抗氧化能力及抗脂质过氧化活性进行评价，为综合开发利用广藿香资源提供参考，同时为广藿香精油的深入研究提供实验依据。

1 实验材料

广藿香精油，经水蒸气蒸馏法提取所得，呈微黄色油状液体。

2 试剂及仪器

2.1 试剂

硫酸亚铁，过氧化氢，邻苯三酚，盐酸，三氯乙酸，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，硫代巴比妥酸，磷酸二氢钠，乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钾；铁氰化钾[K3Fe(CN)6]，磷酸氢二钠，三氯化铁(以上试剂均为市售分析纯)；大豆卵磷脂(生化试剂，北京华清美恒天然产物技术开发有限公司)，总抗氧化能力试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)。

2.2 仪器

752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；旋转蒸发仪，电热恒温水浴锅。

3 方 法

3.1 试剂配制

(1) 0. 05 mol /L Tris - HCl缓冲液 ( pH 值8.2 )

50 mL 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与22.90 mL 0.1 mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL。

(2) 卵磷脂溶液

精确称取200 mg卵磷脂溶解于30 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS中，冰浴振荡。

(3) 37.5 mmol/L EDTA-Fe

准确称取5.7 g硫酸亚铁、7.45 g乙二胺四乙酸二钠，分别溶于200 mL水中，加热溶解，并趁热将硫酸亚铁倒加入乙二胺四乙酸二钠溶液中，混匀，定容到1 000 mL。

3.2 广藿香梯度受试液配制

精确称取广藿香精油0.010 0 g，溶于10 mL二甲基亚砜中，得到1.00 mg/mL受试液。再依次稀释成0.75 mg/mL、0.50 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL的梯度受试液。

3.3 广藿香精油抗氧化活性的测定

3.3.1 对超氧阴离子自由基的清除活性测定[1]

采用邻苯三酚自氧化法：精密量取0.05 mol/L Tris - HCl缓冲液( pH 值 8.2 ) 4.50 mL，置于25 ℃ 水浴中预热20 min，分别加入1.00 mL不同浓度的样品溶液和25 mmol/L邻苯三酚溶液0.40 mL，混匀后置于25 ℃水浴中反应5min，加入8 mmol /L的HCl溶液1.00 mL终止反应。在波长325 nm处测定吸光度。每个试样作3次平行测定，取其均值为A1。另参照上述操作分别测定相应的本底吸光度值A0和A2，按下式计算超氧阴离子清除率：

A0：不含样品的吸光度值；A1：含有样品和邻苯三酚的吸光度值；A2：含样品，但不含邻苯三酚的吸光度值。

3.3.2 对羟自由基的清除活性测定[2]

采用改良的Smirnoff水杨酸法，即利用H2O2与Fe2+反应产生羟自由基，即：H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。用10 mL具塞试管，每管加入10 mmol/L FeSO4溶液和10 mmol /L的水杨酸溶液各 1 mL及不同浓度的样品溶液1 mL，最后加入9 mmol/L的H2O2溶液1 mL启动反应, 并加蒸馏水至10 mL，于37℃水浴30 min后(如有沉淀可离心取上清)，以蒸馏水调零，测定510 nm处吸光度。每个试样作3个平行，取其平均值A1。另参照上述操作分别测定相应的本底吸光度值A0和A2，按下式计算羟自由基清除率：

A0：不加样品，即以1 mL蒸馏水代替样品加入体系中；A1：加样反应；A2：加样但不反应，即以1 mL蒸馏水代替H2O2溶液加入体系中。

3.3.3 对脂质过氧化抑制活性的测定[3]

精密量取0.50 mL卵磷脂溶液，加入pH 7.4 PBS缓冲液1.00 mL，不同浓度的样品溶液1.00 mL，2.5 mmol/L EDTA-Fe(Ⅱ)1.00 mL，混匀后37 ℃水浴中反应45 min，再加入28%(w/v)的TCA 2.00 mL，1%(w/v)的TBA1.00 mL，混匀后置于100 ℃沸水浴中加热10 min，冷却后在532 nm处测定吸光度。用PBS缓冲液调零，空白管用PBS缓冲液代替样品测吸光度A0。每个试样作3个平行，取其平均值A1。按下式计算脂质过氧化抑制率：

A0：不含样品的吸光度；A1：含样品的吸光度。

3.3.4 还原能力的测定[4]

精密量取不同浓度的样品溶液2.50 mL于试管中，依次加入2.50 mL 0.20 mo1/L磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和2.50 mL l%铁氰化钾溶液，于50 ℃水浴保温20 min后，快速冷却，再加入2.50 mL 10%三氯乙酸，以3 000 r/min离心10 min，取上清液2.50 mL，依次加入2.00 mL蒸馏水，0.50 mL 0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，在700 nm处测吸光值, 吸光值越大表示还原力越强(以蒸馏水作参比)。每个试样作3个平行，取其平均值。

3.3.5 总抗氧化能力的测定

按试剂盒说明书操作。

以上实验均以抗坏血酸(Vc)为阳性对照。

4 结果及分析

4.1 广藿香精油抗氧化活性测定结果

4.1.1 广藿香精油清除超氧阴离子自由基的能力

广藿香精油对超氧阴离子自由基的清除能力测定结果见图1。

超氧阴离子是所有氧自由基生成中的第一个自由基，它们攻击生物大分子，使其交链或断裂，引起细胞结构和功能的破坏，从而造成衰老，因此测定对超氧阴离子自由基的清除作用有重要意义。

图1 广藿香精油清除超氧阴离子自由基能力

邻苯三酚自氧化法是测定清除超氧阴离子自由基活性的常用方法。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化释放超氧阴离子自由基，并生成有色中间产物，当有抑制剂存在时，可清除超氧阴离子自由基，从而阻止中间产物的积累，所以可通过比色法来检测有色中间产物的含量，以检验物质清除超氧阴离子自由基的能力。

由图1可看出，在实验浓度范围内，随维生素C及样品浓度的升高，二者对超氧阴离子自由基的清除率都有升高。其中，维生素C的上升趋势较快，在浓度为0.64 mg/mL时，达到半数抑制率；而广藿香精油对超氧阴离子自由基的抑制率虽有升高，但趋势较为缓慢，在1.00 mg/mL的浓度下，其抑制率将近40%。

4.1.2 广藿香精油清除羟自由基的能力

广藿香精油对羟自由基的清除能力测定结果见图2。

图2 广藿香精油清除羟自由基能力

羟自由基是人体中最活泼、对机体危害最大的自由基，它可与脂类、多肽、蛋白质和DNA 等反应，引发不饱和脂肪酸氧化，形成脂质过氧化物(LPO)，破坏膜结构，导致细胞和组织器官损伤，诱发各种疾病，加快生物体的衰老。

由图2可看出，在实验浓度范围内，随着浓度的增大，维生素C清除羟基自由基作用显著，且清除能力与浓度有明显的量效关系，其半数抑制浓度(IC50)值为0.39 mg/mL；广藿香精油对羟自由基具有一定的清除作用，但是较弱。在实验浓度范围内，抑制率随浓度的增大有缓慢的升高，在1.00 mg/mL的浓度时，其抑制率达到31.35%。

4.1.3 广藿香精油抗脂质过氧化的能力

卵磷脂可被·OH氧化损伤产生丙二醛(MDA)类似物，硫代巴比妥酸(TBA)可与MDA类似物反应生成粉红色物质，该物质在532 nm处有最大光吸收[27]。通过测定加有广藿香精油的待测液在532 nm吸光度值，即可检测广藿香精油的抗脂质过氧化能力。

广藿香精油的抗脂质过氧化能力测定结果见图3。

图3 广藿香精油抗脂质过氧化能力

由图3可以看出，广藿香精油对Fe2+引发的卵磷脂脂质体过氧化有抑制作用，抑制率随着浓度的增加而缓慢增大。在浓度低于0.50 mg/mL范围内，其抑制率要高于维生素C对脂质过氧化的抑制作用；而随着浓度的升高，在高于0.50 mg/mL的浓度范围，维生素C的抑制作用显著增加，高于广藿香精油的抗脂质过氧化能力。

4.1.4 广藿香精油的还原力

广藿香精油的还原力测定结果见图4，阳性对照维生素C的还原力测定结果见图5。

图4 广藿香精油的还原力

一种物质的还原能力与它潜在的抗氧化活性有十分密切的关系。由图4、5可以看出，在实验浓度0～1.00 mg/mL范围内，随着浓度的增大，广藿香精油的还原力与浓度存在着明显的量效关系。但广藿香精油的还原力偏低，在浓度1.00 mg/mL时，其还原力只有0.134；维生素C的还原力很强，在浓度10.00 μg/mL时，其还原力达到1.252。

图5 维生素C的还原力

4.1.5 广藿香精油的总抗氧化能力

总抗氧化能力(T-AOC)的试剂盒法测定原理为：机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+。而Fe2+可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色法可测出其抗氧化能力的高低。经过测定：广藿香精油的总抗氧化能力为39.29 U/mg，维生素C的总抗氧化能力为324.93 U/mg。

5 结 论

《中华人民共和国药典》(2005年版)已收录了多种广藿香制剂, 临床上用于治疗脘腹胀痛、呕吐腹泻和痢疾等[5]。有研究表明, 广藿香精油对常见的肠道致病菌、几十种皮肤致病菌和多种植物病原菌具有抑制作用[6-10 ];对寄生于人体的伯氏虐原虫也有毒杀增效作用[9]。广藿香精油的主要化学成分是广藿香酮、广藿香醇、木醛酮、表木醛醇、广藿香烯和异愈创木烯等[ 7, 9, 12-13]。虽然中药广藿香的药理作用已研究透彻，但其精油的抗氧化作用尚不清楚。

综上所述，广藿香精油能够清除超氧阴离子自由基、羟自由基，可以抑制脂质过氧化，具有一定的还原能力和总抗氧化能力，即它具有良好的综合抗氧化能力，作为一种自由基清除剂和抗氧化剂，在药用和化妆品产业化方面将具有良好的开发应用前景。

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Antioxidant Activity of Essential Oil of Patchouli

Zhang Limin, Jiang Tao*

(The Pharmacy Institute of Jiangsu Tumor Hospital, Nanjing 210008, China)

Pogostemoncablin(Blanco) Benth., one of the commonly used herbs, is rich in volatile oil. Its pharmacological activity is clear, but the antioxidant activity of patchouli oil has been reported rarely. In this paper, patchouli oil was evaluated in scavenging hydroxyl radicals, superoxide anion activity, reducing power, total antioxidant capacity and anti-lipid peroxidation activity. This study provided experimental basis of in-depth study of antioxidant of patchouli oil.

Patchouli oils ; antioxidant activity; study

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.008

2016-05-08

张丽敏(1976—)，主管药师,主要从事中草药化学方面的研究工作。

Q946

A

1006-9690(2016)06-0031-04

*通讯作者： 姜涛(1986—)，主管药师,主要从事中药化学方面的研究工作。