凤仙花叶片提取物及萘醌类物质抑菌活性研究

姜洪芳, 孙 钢, 张 莉, 石宝俊, 束成杰, 张卫明*

(1. 南京野生植物综合利用研究院, 江苏 南京210042; 2. 靖江市人民医院, 江苏 靖江 214500)



凤仙花叶片提取物及萘醌类物质抑菌活性研究

姜洪芳1, 孙 钢2, 张 莉2, 石宝俊1, 束成杰1, 张卫明1*

(1. 南京野生植物综合利用研究院, 江苏 南京210042; 2. 靖江市人民医院, 江苏 靖江 214500)

采用滤纸片法测定凤仙花叶片55%乙醇回流提取物及其所含的指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌对大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌抑制活性。结果表明，凤仙花叶片提取物在25.0 mg/mL时对受试的3种菌均有较好的抑制作用。指甲花醌浓度为1.56 mg/mL时，对白色念珠菌、绿脓杆菌的抑菌活性强于对大肠杆菌的抑制作用。2-甲氧基指甲花醌对白色念珠菌的抑菌活性强于对绿脓杆菌、大肠杆菌的抑制作用，对白色念珠菌的最低抑制浓度小于0.78 mg/mL。

凤仙花叶片提取物；指甲花醌；2-甲氧基指甲花醌；抑菌活性

凤仙花 (ImpatiensbalsaminaL.) 为凤仙花科 (Balsaminaceae) 凤仙花属 (Impatiens) 一年生草本植物，其全草、花、根、果皮和种子均可入药，其中花、茎、叶、种子在民间有悠久的药用历史，被广泛用于各种中药配方中，用于治疗蛇咬伤、 鹅掌风、 风湿性关节炎、 痈疖疮疔等[1-2]，种子急性子为《中国药典》(2010年版)收载品种。化学成分主要有黄酮、萘醌、香豆素、有机酸、花青素和甾醇类[3]。据报道指甲花醌和2-甲氧基-1,4萘醌是该植物抗细菌和抗真菌的活性成分[4-6]，此外，2-甲氧基-1,4萘醌具有很强的对抗HepG2细胞的抗肿瘤活性。

现阶段国内外已对凤仙花朵化学成分及其粗提物的抗细菌活性或者抗真菌活性进行了研究。本实验选取常见的细菌大肠杆菌、绿脓杆菌和常见真菌白色念珠菌，一方面研究凤仙花叶片提取物抑菌活性，另一方面比较凤仙花叶片萘醌类单体的抑菌活性，以确定起主要抑菌作用的化合物，为凤仙花叶片这一资源的利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料及菌种

凤仙花叶片提取物：称取已粉碎的凤仙花叶片20 g，用55%乙醇回流提取3次 (每次3 h) ，合并提取液，60 ℃浓缩至无醇味。指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌自制 (纯度>90%)。乙醇、蒸馏水、蛋白胨、牛肉膏、琼脂等试剂均为分析纯或生物制品。

大肠杆菌 (Escherichiacoli)，白色念珠菌(Candidaalbicans)，绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa) 以上菌种均由南京野生植物研究院提供。

1.2 仪器与试剂

抑菌实验所需仪器与试剂：PH酸度计 (梅特勒公司)、电子天平 (梅特勒公司)、磁力揽拌器 (上海科升仪器有限公司)、生化培养箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司)、SW-CJ-ZFD超净工作台 (苏净集团苏州安泰技术有限公司)、立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂)、THZ-072-HT小型摇床 (上海博彩生物科技有限公司)、KQ3200E超声波清洗器 (昆山超声波有限公司)、离心机、真空干燥器、打孔器 (2.5 mm)、镊子。

1.3 培养基[7]

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水 l 000 mL, pH7.0～7.2，121 ℃灭菌 20 min。LB 培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，琼脂10.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1 000 mL。

1.4 菌液的制备

采用比浊法制备各种菌悬液。菌种经活化接种于试管斜面培养基培养 (37 ℃，24～36 h) 用无菌水稀释，菌液的孢子浓度控制在 107～108cfu/mL，备用。

1.5 抑菌活性测定

采用滤纸片稀释法，供试菌为大肠杆菌，白色念珠菌，绿脓杆菌。凤仙花叶片提取物用吐温-80、丙二醇分别溶解成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5mg/mL、6.25 mg/mL的溶液。指甲花醌溶解成12.50 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL的溶液，2-甲氧基指甲花醌溶液的浓度分别为12.50mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL，青霉素阳性对照12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL。将菌种活化后，挑去菌落于150 mL的LB液体培养基中，于37 ℃恒温振荡培养10 h，每个培养皿分别加入20 μL菌液及10 mL培养基。摇匀，加入含有样液的滤纸片，倒置，37 ℃恒温培养24 h，观察抑菌圈大小，重复3次，取其均值，同时制备空白对照培养基。

2 结果与分析

凤仙花叶片提取物、指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌在不同浓度下进行大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌抑菌活性测定。实验结果见表1～3。可以看出，凤仙花叶片萘醌单体化合物比提取物有较强的抑菌作用。当凤仙花叶片提取物浓度为25.00 mg/mL时，对实验菌种绿脓杆菌、白色念珠菌的抑制作用较大肠杆菌强，其中对白色念珠菌的抑菌作用较强。指甲花醌、2-甲氧基指甲花醌对绿脓杆菌、白色念珠菌的最低抑菌浓度均为1.56 mg/mL，指甲花醌对大肠杆菌的最低抑菌浓度为3.125 mg/mL，而2-甲氧基指甲花醌在实验浓度下对大肠杆菌无抑制作用。

表1 凤仙花叶片提取物的抑菌作用 (抑菌圈直径: mm)

注：“—”表示无抑菌作用。

由表1可以看出，凤仙花叶片提取物对大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌有抑菌活性作用。当浓度为25.0 mg/mL时，除大肠杆菌外，对绿脓杆菌、白色念珠菌均有抑菌活性。当浓度为50.00 mg/mL时，对上述2种细菌和真菌均有抑菌作用。

表2 指甲花醌的抑菌作用 (抑菌圈直径: mm)

注：“—”表示无抑菌作用。

由表2可以看出，指甲花醌对白色念珠菌、绿脓杆菌的抑菌活性强于对大肠杆菌的抑制作用。当浓度为1.56 mg/mL时，除大肠杆菌外，对绿脓杆菌、白色念珠菌均有抑菌活性。当浓度为3.125 mg/mL时，对上述2种细菌和真菌均有抑菌作用。

由表3可以看出，在受试浓度下对大肠杆菌无抑制活性。2-甲氧基指甲花醌对白色念珠菌的抑菌活性强于对绿脓杆菌的抑制作用，当浓度为1.56 mg/mL时，除大肠杆菌外，对绿脓杆菌、白色念珠菌均有抑菌活性。对白色念珠菌的最低抑制浓度应当低于0.78 mg/mL。

表3 2-甲氧基指甲花醌抑菌作用 (抑菌圈直径: mm)

菌种名称2-甲氧基指甲花醌最低抑菌浓度(MIC)/(mg/mL)12．56．253．1251．560．78青霉素对照品/(mg/mL)12．56．253．125大肠杆菌—————11．610．48．25绿脓杆菌11．9511．657．36．75—108．37．5白色念珠菌11．8510．910．159．18．35———

注：“—”表示无抑菌作用。

3 结 论

凤仙花叶片提取物在25.0 mg/mL对常见细菌和真菌均有较好的抑制作用。单体实验表明，指甲花醌浓度为1.56 mg/mL时，对白色念珠菌、绿脓杆菌的抑菌活性强于对大肠杆菌的抑制作用。2-甲氧基指甲花醌对白色念珠菌的抑菌活性强于对绿脓杆菌、大肠杆菌的抑制作用，对白色念珠菌的最低抑制浓度小于0.78 mg/mL。由此说明萘醌类物质是凤仙花叶片抑菌作用的主体，以往的实验表明凤仙花瓣有较强的抑菌作用，外用时可治疗鹅掌风、灰指甲、湿疹及癣疮等。本次试验表明凤仙花叶片提取物也有较好的抑菌作用，增加了凤仙花的用药部位，确定叶片中含有的萘醌类物质作为抑菌活性的主体，能抑制细菌和真菌的生长，尤其对绿脓杆菌、白色念珠菌有很强的抑制作用。而其对其他菌类的抑制活性及抑菌机理有待进一步研究。

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[2] 王倩, 苗明三. 凤仙花化学、药理及临床应用分析[ J ]. 中医学报, 2014, 29 (6) : 862-864.

[3] 胡喜兰, 朱慧, 刘存瑞, 等. 凤仙花的化学成分研究[ J ]. 中成药, 2003, 25 (10) : 833-834.

[4] 秦海宏, 李德旺, 孙丽娟, 等. 凤仙花水提物体外和体内的抑菌活性[ J ]. 吉林大学学报(医学版), 2013, 39 (1) : 60-64.

[5] 马红梅, 黎秋华, 岑红焕. 凤仙花叶不同提取物对细菌的抑制作用 [ J ]. 山东农业大学学报( 自然科学版) , 2012, 43 (2) : 193-196.

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[7] 李明远. 微生物学与免疫学 [ M ]. 北京: 人民卫生出版社, 2002 : 84-126.

Antimicrobial Activity of the Leave Extracts and Naphthoquinones from Impatiens balsamina L.

Jiang Hongfang1, Sun Gang2, Zhang Li2, Shi Baojun1,Shu Chengjie1, Zhang Weiming1 *

(1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2. People's Hospital of Jingjiang, Jingjiang 214500, China)

The aim of this study was to investigate antimicrobial activities of 55% ethanol leave extraction, lawsone and 2- methoxy-1,4-naphthoquinone ofImpatiensbalsaminaL. to bacteria (such asEscherichiacoli,Pseudomonasaeruginosa) and fungi (such asCandidaalbicans). The results revealed that leave extraction at the concentration of 25.0 mg/mL can inhibit three kinds of bacteria, inhibition of bacterial is:C.albicans >P.aeruginosa>E.coli. Lawsone at the concentration of 1.56 mg/mL can better inhibitC.albicans andP.aeruginosathanE.coli. 2- Methoxy-1,4-naphthoquinone at the concentration of 0.78 mg/mL can better inhibitC.albicans thanP.aeruginosaandE.coli.

ImpatiensbalsaminaL. leave extracts; lawsone; 2- methoxy-1,4-naphthoquinone; antibacterial activity

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.006

2016-05-12

国家“十二五”科技支撑计划(2012BAD36B01)。

姜洪芳，副研究员，主要研究天然产物活性物质应用与开发,E-mail:jhf74@163.com

*通讯作者： 张卫明。 E-mail: botanyzh@163.com

Q946

A

1006-9690(2016)06-0024-03