髓核细胞与干细胞共培养的研究进展

薛鹏举敖 俊* 赵利涛郭明柯吕海文姬文慧黄欢欢秦耀宗张伟锋周卫敏

（1 河南科技大学第二附属医院，河南 洛阳 471000；2 遵义医学院脊柱外科，贵州 遵义 563003）

髓核细胞与干细胞共培养的研究进展

薛鹏举1敖 俊2* 赵利涛1郭明柯1吕海文1姬文慧1黄欢欢1秦耀宗1张伟锋1周卫敏1

（1 河南科技大学第二附属医院，河南 洛阳 471000；2 遵义医学院脊柱外科，贵州 遵义 563003）

讨论开展髓核细胞与干细胞共培养相关研究现状进展。通过对种子细胞、共培养方式、生长因子等方面国内外研究进展进行讨论。通过椎间盘组织细胞与干细胞共培养增加细胞数量或诱导干细胞分化为髓核细胞可能是一种增加椎间盘细胞较为适当的方法。通过细胞共培养技术可能分泌延缓退行性变在组织细胞中发生发展提供新的途径，也是目前研究的热点。基础研究及临床应用有着广阔科研前景。

干细胞；共培养；椎间盘组织工程学；髓核细胞

椎间盘退行性变常是的下腰痛病因，患者生活质量受到严重影响，甚至有一定的致残率。近年来椎间盘退行性变的发病率呈逐渐上升。从病理学上观察，由于髓核细胞合成分泌Ⅱ型胶原蛋白的能力出现下降，使细胞外胶原蛋白种类成分改变，将导致椎间盘结构的变化和功能的减退[1]。若从改善髓核细胞功能入手，使髓核的再生或减慢老化。就现有治疗而言，卧床休息与牵引治疗只能够暂时性的缓解患者的疼痛等临床症状，无法延缓或逆转椎间盘退变的发展。而各种手术虽去除了发生退变的椎间盘，但易产生术后腰椎不稳，椎弓根钉棒系统内固定使局部脊柱活动度下降，临近椎间盘负荷过多，导致临近椎体出现退变过早发生。椎体间植骨融合不仅治疗费用昂贵，且存在植骨不愈合可能。安装非融合内固定，以尽量恢复原有关节活动度，亦存在内固定物松动、脱落等风险。因此，治疗椎间盘退行性变的关键应该在椎间盘的退变的病理组织结构基础的改变，恢复椎间盘原有结构基础与主要功能。现阶段国内外主要的研究集中在采用组织工程学技术和方法直接修复退变的椎间盘髓核组织，从而使椎间盘组织结构和功能恢复。具体就是促进椎间盘细胞分泌正常的椎间盘细胞外基质，改善椎间盘细胞生存的微环境，并且通过抑制用于分解代谢过程的相关酶及炎性介质，促进其恢复正常功能与结构。由于髓核组织体积较小，易造成组织分离提取困难，即便培养出的髓核细胞，其数量及扩增亦较为困难，且其形态易出现老化[2-3]。通过椎间盘组织细胞与干细胞共培养增加细胞数量或诱导干细胞分化为髓核细胞可能是一种增加椎间盘细胞较为适当的方法。通过细胞共培养技术可能分泌延缓退行性变在组织细胞中发生发展提供新的途径，也是目前研究的热点。本文就人髓核细胞与干细胞共培养方面进行研究现状的讨论。

1 种子细胞

1.1 椎间盘细胞：正常人类的髓核组织，在儿童时期存在脊索细胞和髓核细胞两种细胞，但随着年龄的增长脊索细胞持续减少，大约超过10岁后绝大部分被髓核细胞所取代[4-7]。大部分关于脊索细胞的研究多见于动物实验中，而对人类椎间盘髓核组织的研究而言，髓核细胞的研究明显较脊索细胞更具有实际意义。许多需要行手术切除髓核组织的患者，以成年人多见。但人类髓核细胞体外增殖的能力弱，同时体外培养条件较为严格。而成人椎间盘组织内含有的髓核细胞数量少，且容易老化。人髓核细胞来源亦成为，现有学者以先天性脊柱侧弯患者所行的矫形手术中获得切除的椎间盘髓核组织为研究来源，但先天性脊柱侧弯疾病发病率相对其他病种低，病源有限。亦有学者通过对椎间盘突出患者所行的椎间盘髓核摘除术中获得髓核组织，但此类患者的椎间盘已发生退行性变，患者年龄往往偏大，所获得的髓核细胞增殖能力及合成蛋白的功能不能肯定，将此作为种子细胞应用于组织工程学研究或临床治疗可能并不恰当。笔者临床工作中发现许多人颈椎骨折患者需要行前路手术摘除髓核组织，而摘除后的髓核组织，最终被手术人员丢弃，通过对人颈椎骨折患者术中摘除的髓核组织研究发现其可以培养出髓核细胞，而此类患者具有年龄较小，患病人数高且稳定，取材简便的特点。因此现阶段开展髓核细胞相关研究，应结合当地特点，选择适宜髓核细胞的来源。髓核细胞一直缺乏统一的鉴定标准。现阶段对髓核细胞的研究多采用Ⅱ型胶原蛋白免疫组化方法结合细胞形态学特点进行鉴定。鉴于流式细胞技术在细胞实验研究的广泛，有学者探索使用荧光抗体结合细胞表面标志物来鉴定细胞。但目前研究发现，髓核细胞缺乏高度表达且特异性高细胞表面标志物，使得流式细胞技术鉴定髓核细胞仍处于实验阶段，而髓核细胞新的鉴定技术本身就是正在处于研究的课题。

1.2 干细胞：干细胞具有分化为临近组织内其他细胞的能力，这可能是受损组织能进行自我修复的原因。这就为老化受损的椎间盘提供了一种新的修复可能，也为稀缺的髓核细胞提供了新的扩增方法。但最为原始干细胞的胚胎干细胞，尽管理论上分化潜能最强，但受伦理学及相关法律文件限制，只能在动物实验范围内进行，所取得的成果一般无法同样在人细胞相关领域应用。选择伦理学争议较少的干细胞进行研究，用于椎间盘髓核细胞组织工程学相关研究是需要开展的研究领域。现阶段间充质干细胞常见于文献报道，但间充质干细胞种类繁多，需要大量实验开展以选则合适的干细胞用于髓核细胞相关研究。现阶段对骨髓、脂肪以及脐带等易获组织来源进行提取，不仅是间充质干细胞易于培养，其分化诱导能力已经逐渐被研究人员所证实。而最近人脐带血间充质干细胞因其较其他细胞分类上更为原始，而因其科研工作者的重视。而现在此细胞的培养技术已较为成熟。从现有文献来看，脐带血源性间充质干细胞可以被分化为内、外及中胚层的部分细胞[8]。而人髓核细胞系从内胚层分化而来。诸如脂肪细胞、神经细胞及干细胞可以由此种干细胞诱导出来。而肝脏细胞属于内胚层分化细胞，若能存在被诱导分化为肝细胞的间充质干细胞，将更有可能被诱导分化为椎间盘细胞。与华通胶类的组织相比，脐带血作为血液可能更容易提取细胞。一般组织类物质需要酶消化法或组织块法进行提取，此方法一般耗时较多。而血液源性细

胞的提取，则依靠密度差异进行离心获得，可以省去大量操作时间。据现有文献报道，大部分间充质干细胞用于髓核研究的多是利用骨髓或脂肪为来源。而更为原始，分化能力可能更强，具有向内胚层细胞分化能力的脐带血间充质干细胞则未见文献报道与诱导髓核细胞的相关研究。在品种繁多的各种间充质干细胞中，筛选出最为适宜作为髓核细胞共培养是目前有待探索的项目。如果以治疗椎间盘退行性变为目的，则不仅需要此类干细胞具有增加髓核细胞数量作用，还应该具备维持细胞蛋白合成和表达的能力。现阶段通过基因扩增技术，蛋白印记技术均可以更为准确检测出蛋白合成的变化。而细胞共培养技术又能为细胞分化、增殖和改善蛋白合成及分泌提供途径。已有研究发现骨髓造血干细胞分泌信号因子，可以作用于共培养体系中的髓核细胞，从而产生使髓核细胞增殖并提高蛋白表达的作用。由此可见，细胞共培养技术是可以用于椎间盘组织工程学研究的，它可以为细胞信号因子及细胞间接触性传代的物质提供适宜场所，延缓髓核细胞的老化。可见，如果能获得大量关于间充质干细胞与髓核细胞共培养的结论性信息，应该可以为椎间盘退行性变的临床治疗提供更多特殊手段，比如是否可以通过细胞移植的方法延缓组织老化过程等，这些由都需要大量实验来完成对它的了解。赵晨成[9]研究发现骨髓间充质干细胞具有着向椎间盘细胞分化的能力，而且其与髓核细胞的作用可能是相互促进的。一些间充质干细胞分泌的细胞调节因子可能作用于髓核细胞内，使得胶原蛋白表达得以增强。这就提示我们，即便是一些干细胞不能被诱导分化为椎间盘细胞，也存在着临床应用治疗退变的潜在价值。而不单局限于仅靠培养出的髓核或类髓核细胞的移植来修复老化的椎间盘。现有文献可见被诱导为髓核细胞的干细胞[10-12]。但研究并为扩大至全部可以培养的间充质干细胞，于海微[13]对比多种间充质干细胞发现在诱导分化能力上可能人脐带血间充质干细胞较强，故而笔者推荐有其他间充质干细胞培养经验的科研团队，尝试使用脐带血间充质干细胞进入髓核细胞领域的研究。只用通过更多种类的干细胞共培养才能明确适宜椎间盘修复的相关研究。另外，除分化至内胚层源性细胞外，脐带血间充质干细胞还有很多生物学特性与髓核细胞相类似。比如其原代贴壁时长等较慢等。凡间充质干细胞均可采用同样的流式细胞仪技术，对其细胞膜表面的特异分子进行鉴定。故而有骨髓间充质干细胞培养经验的实验室可以更为容易地进行此类细胞的培养及鉴定。而髓核细胞与干细胞共培养，应当扩大干细胞种类的范围，以寻找适合椎间盘组织工程学种子细胞。

2 共培养的方式

细胞共培养是细胞生物学研究的重要方法，通过将两种不同种类的细胞放置在同一个容器中进行培养，通过直接或间接接触，从而促使细胞产生特定的作用。但两种细胞以不同的比例共培养后，结果可能有所不同。若干细胞数量较少，可能难以分泌促进髓核细胞增殖或合成蛋白的细胞因子等物质。如果髓核细胞数量较少，则可能不能诱导干细胞定向地往类髓核细胞方向分化。所以共培养时不同细胞所需添加的不同比例，也是在细胞共培养时需要研究的问题。谢小波通过实验研究发现，髓核细胞与骨髓间充质干细胞进行细胞共培养时，当髓核细胞和骨髓间充质干细胞比例为1∶3～2∶l时，髓核样细胞增殖能力会随髓核细胞相对数量增加而降低，而这一比例继续增加时，髓核样细胞增殖能力无明显提高或降低。尽管大多文献支持间充质干细胞略多于髓核细胞时，能促进髓核细胞的增殖。但对于初次进行细胞共培养的学者来说，常规可以选择1∶1比例培养进行尝试。

可采用不同细胞直接混合的接触式共培养，也可采用细胞表面相互分隔的非接触式共培养实现不同细胞相互诱导作用的研究。接触式共培养是按不同比例混合细胞进行培养，不同种类细胞可以直接接触，通过细胞分泌的细胞因子或直接接触相互作用。通过接触式共培养，不同种类的细胞可以获得更大的接触面积，诱导作用可能更为显著。由于接触式共培养，细胞间物质传递距离较短，诱导作用的发生也可能较早。而非接触共培养则将细胞种植于通过具有微小空隙的共培养容器或材料中，使不同种类的细胞隔开。不同细胞旁分泌出的细胞信号因子释放入共培养中共用的培养液，但不同种类的细胞彼此不直接接触。细胞因子再通过穿梭于容器或材料中的微小的空隙，作用于共培养容器或材料中的不同种类的细胞。现阶段研究表明，接触式共培养更利于髓核细胞对间充质干细胞发挥诱导分化的作用[14]，由于接触式共培养体系下，髓核细胞与间充质干细胞可以充分接触，诱导机制可以通过旁分泌细胞信号因子和直接细胞膜接触等多种方式进行。但非接触共培养由于有微孔材料的分隔开，对实验结果的后期处理较接触式共培养容易。非接触共培养用的Transwell培养板的培养孔内由聚碳酸酯膜分隔成两层，孔径大小一般可在微米水平范围内选择。因此可以将不同种类的细胞分别种植于Transwell培养板的不同隔层进行共培养。由于细胞没有直接混合在一起，需要单独分析间充质干细胞或者髓核细胞时，Transwell培养板可以通过酶消化获得。亦有学者使用藻酸钠微球来实现细胞共培养。藻酸钠微球通过藻酸盐溶液与氯化钙混合形成，共培养结束后，可以通过柠檬酸钠溶液溶解微球获得微球内的细胞[15]。而若共培养方式采用直接接触式，则需要预先对某一种细胞进行特异性的荧光标记，以便在共培养结束后通过流式细胞仪的筛选，恢复原先细胞所在的种类。由于细胞对不同材料亲和力，选择何种材料利于种子细胞生长亦成为组织工程学研究的方向之一，李长青通过对髓核细胞在不同支架上培养研究，证实由壳聚糖联合藻酸盐凝胶所制作的支架利于髓核细胞的培养[16]。

3 生长因子

最近研究发现，在细胞因子的诱导下，细胞的生长速度、分化方向等都可能发生改变。在脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞用Transwell培养板共培养时，转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1 具有促进脂肪间充质干细胞分化为髓核细胞的趋势[17]。满孝旭认为肝细胞生长因子对髓核细胞是否也有促进增殖作用，且能在联合应用胰岛素样生长因子1下促进增殖作用增强[18]。在已知能促进细胞增殖以及具有增加细胞蛋白表达的各种细胞信号因子中，筛选出能有效作用于髓核细胞促进其增殖，或者增加其诱导干细胞向类髓核细胞分化上的作用是必要的。

4 小 结

髓核细胞与干细胞共培养是椎间盘组织工程学研究的重要途径，科研范围较为广阔。随着国内外研究的进展，髓核细胞与干细胞共培养技术将为椎间盘组织工程学提供更多的思路和方法，远期也将推动椎间盘退行性变的新的治疗技术的进步。

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R318.0；R68

A

1671-8194（2016）32-0022-03

胸腰椎爆裂骨折单侧椎管减压椎体内植骨、椎弓根螺钉固定术的生物力学研究，贵州省科技厅科学技术基金课题No：黔科合J字20102179号

*通讯作者:E-mail: ao00jun@163.com