马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验的影响因素

唐艳荣 张海云 张雪梅 王艳红 杨 荣

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）



马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验的影响因素

唐艳荣 张海云 张雪梅 王艳红 杨 荣

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

[摘 要]在马传染性贫血防治（简称马传贫）工作中，仍以琼脂凝胶免疫扩散试验为主要检测手段。该方法简便特异、快速。但是，该试验容易受到多种因素的影响，使试验特异性、敏感性、精确性不理想，结果判断的不准确。本文就抗原、抗体性质、琼脂板以及反应条件等各种影响因素及试验中的注意事项对马传染性贫血病琼脂凝胶免疫扩散试验的影响进行了逐一分析。

[关键词]马传染性贫血 琼脂凝胶免疫扩散试验 影响因素 注意事项

马传染性贫血病是马属动物以反复发作、贫血和持续病毒血症为特征的传染性疾病，被世界动物卫生组织列为B类疫病，我国农业部列为二类动物疫病。琼脂凝胶免疫扩散试验诊断方法是根据OIE《诊断试验和疫苗标准手册》和我国实际情况制定。该方法在国际贸易中为指定的诊断方法，并且简便特异。长久以来各地区在防治马传贫工作中，仍以琼脂凝胶免疫扩散试验法为主要检测手段。

但是，该试验容易受到多种因素的影响而导致试验特异性、敏感性、精确性以及结果判断的不准确。本文笔者根据多年试验经验，就各种因素及试验注意事项对琼脂扩散试验的影响进行了逐一分析。以供同行们参考。

1 试验的影响因素

1.1 抗原、抗体因素

1.1.1 抗原、抗体的水溶解性

马传贫琼脂扩散试验是利用可溶性的抗原与抗体在琼脂凝胶网格中的水中自由扩散，相互结合形成的沉淀线来判断结果的。该试验要求抗原与抗体必须是水溶性的，所以一些颗粒性的抗原如细菌、红细胞等是不溶的，这样的抗原相对应的抗体效价就不能用琼脂扩散试验来测定。抗体在非等电点pH值都是水溶性的，所以，试验中调节好琼脂板的pH值就不会影响抗体的水溶性。抗原抗体的水溶性是琼脂扩散实验的首要条件。

1.1.2 抗原、抗体浓度和纯度

马传贫琼脂扩散试验中所形成的沉淀线的粗细、清晰度与抗原抗体的量成正比。抗原、抗体浓度较高时，试验的敏感性提高，容易形成清晰可见的沉淀线。但是浓度过高就有可能导致连线或无法判断结果。抗原与其对应的抗体的反应属于特异性反应。但是如果两者纯度较低，含有过多与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等非特异性物质，往往抑制抗原抗体的特异性、敏感性。

1.1.3 抗原、抗体的反应比例

在马传贫琼脂扩散实验中，过多的抗原或抗体都可能降低实验敏感性。当抗原抗体的反应比例适宜时，抗原抗体结合后尚未达到饱和的位点可与其他游离的抗原抗体继续结合，逐渐形成越来越大的复合物，最后在抗原与抗体孔之间形成肉眼可见的沉淀线。此时反应最快、最明显。但当两者的反应比例不适合时，少的一方在聚合初期就达到饱和，沉淀线变得不清晰甚至没有沉淀线，而且沉淀线偏移，向量少的一方移动。

1.2 琼脂及琼脂板因素

1.2.1 琼脂粉的质量

琼脂中的不溶性杂质和矿物质等是影响琼脂扩散试验结果主要因素。不溶性杂质能直堵塞琼脂的网格，这样的杂质过多会影响抗原抗体的扩散，为了避免这些杂质的影响，可选择高质量的琼脂糖制作琼脂板。琼脂中的矿物质、金属盐离子等可能导致抗体、抗原变性或被破坏，影响实验结果精确性。

1.2.2 琼脂的浓度、黏度

在此琼脂扩散实验中琼脂主要作为一种空间支持结构。它溶于水冷却凝固后内部形成多孔的网状结构。可允许大分子物质自由通过。而孔径的大小与琼脂浓度成反比。实验中常用的琼脂浓度为0.8%～1.5%。1.0%琼脂凝胶孔径为85nm，大多数抗原、抗体都可以在琼脂中自由扩散。所以，实验中如果琼脂浓度增大容易阻滞抗原、抗体的扩散，降低实验敏感性。琼脂的浓度应该根据具体实验的要求进行确定。琼脂质量和加热溶解过程水分蒸发是导致琼脂浓度变化的主要原因.实验中应予以注意。另外，琼脂的黏度也是影响实验结果的因素之。琼脂黏度过大，抗原抗体扩散速率减慢，降低实验敏感性。

1.2.3 电解质

电介质的存在可以降低免疫复合物表面的阴电荷，促使其沉淀。所以，适当浓度的电介质对免疫复合物沉淀线形成有促进作用。但是，过高浓度的电解质反又不利于抗原抗体沉淀物的形成。原因：（1）过高浓度的电解质阻止蛋白质与水分子的相互作用，破坏蛋白质表面的水化层.产生盐析效应，使抗原抗体发生非特异性的沉淀；（2）抗体复合物形成是一个动态过程。过高浓度的电解质可使抗原抗体结合物离解。过高浓度的电介质能降低实验的特异性、精确性。临床中最常用的电解质为pH7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）。

1.2.4 琼脂的熬制时间

按1%左右（0.8%～1.5%）的比例加入pH7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS），水浴煮沸融化最好不少于20 min。一方面，要待琼脂完全溶解，琼脂溶解不完全将会严重影响抗原、抗体的扩散。甚至直导致试验失败。另一方面，熬制时间过短，制作出的琼脂板易滋生细菌，影响试验的判断。

1.2.5 琼脂板的厚度

琼脂扩散试验使用的琼脂板的厚度应为2～3mm左右，且制作琼脂板时不要产生气泡。如果琼脂板太厚，一方面，可能导致抗原抗体复合物聚合量较少，形成的沉淀线不清晰，降低试验的敏感性。同时，琼脂板太厚又可导致抗原或抗体扩散的不均匀性概率增大，可能出现琼脂底部与表面产生的沉淀线不在一个平面上，沉淀线发生扭曲，影响结果判断。相反，琼脂板太薄也会影响到试验的结果。

1.2.6 孔间距离

抗原抗体的孔间距离也能影响琼脂扩散试验的结果。当两者之间的孔距为3～5mm时。抗原抗体既能形成合适的浓度梯度又能充分结合。当两者的孔间距离过大时，虽然能形成合适的浓度梯度。但由于抗原抗体量太少却不能充分结合，敏感性降低。相反孔距太小，试验敏感性提高，却不能形成合适的浓度梯度。根据要求可按相应模板打孔，也可直用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。挑孔内琼脂时，注意不要挑破孔缘，以免对试验结果有影响。

1.2.7 试验用水的影响

马传贫琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到试验用水的影响。如果实验用水中含大量重金属离子如铅、汞、铜等。会使蛋白质成分的抗原或抗体变性失去活性。不能再发生特异性反应，降低实验结果的精确性。配制pH7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）时使用无离子水和蒸馏水，溶解琼脂可以有效解决该问题。

1.3 反应条件

1.3.1 反应温度

抗原抗体的反应速度、结合程度与反应温度高低有密切关系。温度高，分子运动加快，增加抗原抗体碰撞概率，反应会加快，但当温度过高时反应速度反而变慢，抗原抗体复合物往往会重新解离，甚至会被破坏。反应温度低时，反应速度变慢，但抗原抗体结合完全，沉淀量增多，结果清晰，但温度过低也会导致试验失败。马传贫琼脂扩散试验的最适反应温度为15℃～30℃左右。

1.3.2 空气湿度

马传贫琼脂扩散试验是抗原抗体在琼脂网格的水中扩散时形成的结果，如果空气中湿度太低，琼脂中的水分很容易蒸发，使琼脂网格中的水分减少，琼脂孔径变小，不利于抗原抗体的自由扩散，降低实验敏感度和精确度。所以，在进行琼脂扩散试验时。往往倒置平皿，然后放在一个有湿棉纱布的有盖搪瓷盘中，以防水分蒸发。湿度过大可能使琼脂表面形成水滴，导致抗原、抗体发生混合，也会影响试验结果的判断。

2 注意事项

2.1 加样

样品加入孔内时，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。

2.2 封板

打孔后琼脂底部融封效果也能影响琼脂扩散试验的结果，在火焰上缓缓加热时，且加热要均匀，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏，影响试验结果。

2.3 结果判读

（1）在观察结果时，最好从不同折光角度仔细观察平皿上抗原孔与受检血清孔之间有无沉淀线。为了观察方便，可在与平皿有适当距离的下方，置一黑色纸等，有助于观察。

（2）用做血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带，但两阳性孔的沉淀带末端在近待检孔时，两端均向内有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在近检样孔时变得模糊、消失，可能为待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将样品稀释后重检。

（3）不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。

（4）抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。

总之，多种因素都可以影响到琼脂扩散试验的特异性、敏感性、精确性，甚至导致结果无法判断。这也就要求试验工作者在试验中应严格按照要求进行操作，并积极总结经验及试验中的注意事项，在实践中摸索掌握马传然性贫血琼脂扩散试验的要点。

通讯作者：张海云（1964-），女，本科，高级兽医师，主要从事动物疫病防控工作。

作者简介：唐艳荣（1972-），女，本科，高级兽医师，主要从事动物疫病防控工作。