肉毒中毒症疫苗的研究现状

彭国瑞，彭小兵，李旭妮，杜吉革，蒋玉文

(中国兽医药品监察所，北京100081)

肉毒中毒症疫苗的研究现状

彭国瑞，彭小兵，李旭妮，杜吉革，蒋玉文*

(中国兽医药品监察所，北京100081)

用于预防肉毒中毒症的传统疫苗有灭活菌苗和类毒素疫苗，近年来对于重组亚单位疫苗、重组嵌合体疫苗和DNA疫苗等研究成为热点，文章着重对这些新型疫苗的发展现状进行了综述，以期为相关研究提供借鉴。

肉毒中毒症；毒素；新型疫苗

肉毒中毒症(botulism)是机体经消化道或伤口摄入了肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)或其外毒素肉毒毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)而引起的一种急性、高度致死性、中毒性疾病。肉毒毒素是目前已知毒物中毒性最强的一种，是肉毒梭菌主要的致病性毒力因子，也是防治肉毒中毒症的关键免疫抗原。依据抗原性，毒素分为A、B、C、D、E和F型，其中A、B、E、F型均可引起人食物中毒，A、B型毒素引起马、牛、水貂等动物饲料中毒，C型毒素为马、牛、羊以及水貂肉毒中毒症和水禽软颈病的主要病因，D型毒素是牛、绵羊肉毒中毒的病因。大多数菌株只产生一种毒素，有些可产生两种，但其中一种占优势，如Ab、Af、Ba、Be、Bf，用各型毒素或类毒素免疫动物，只能获得中和相应型毒素的特异性抗毒素。有些产生C/D嵌合毒素，但没有菌株可以同时产生C和D两种毒素，C、D毒素有共同的表位，多抗有交叉反应[1]。尽管各型之间在免疫学特性、毒力、自然致病动物类型上各不相同，但生化作用和结构却极为相似。该毒素通常由相对分子质量约150 kD的单链毒素前体，经内源性或外源性蛋白酶作用产生切口，形成以二硫键相连的双链结构，其中相对分子质量约50 kD较小片段为轻链(light chain，LC)，具有锌依赖金属内肽酶活性，是毒素的毒性作用位点；100 kD较大片段为重链(heavy chain，HC)不具毒性，负责与受体结合及轻链的内化[2]。

肉毒中毒症对公共卫生、安全和畜牧业存在着较大的风险，接种疫苗是预防该病最有效的方法之一。目前针对该病的常规疫苗有灭活疫苗和类毒素疫苗，随着生物技术的发展，重组亚单位疫苗，重组嵌合体疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的研究得到迅速发展。本文将就这些新型疫苗的研究现状进行综述，以期为相关研究提供借鉴。

1 常规疫苗

灭活菌苗是将含特定毒素型肉毒梭菌菌液用甲醛溶液灭活后，加入适当的佐剂或是干燥处理制成，多种毒素型按适当比例添加制成多价苗，或是与预防其他疾病的疫苗一同制成联苗。与菌苗相比纯化后脱毒制备的类毒素疫苗，可以降低杂蛋白可能引起的副反应。美国、德国和俄罗斯研制和储备了单价、三价和五价的类毒素疫苗，主要用于实验室工作人员和执行特殊任务军人的免疫接种[3]。澳大利亚和非洲的一些国家，每年都会对水貂、牛、羊、雉等畜禽进行类毒素免疫接种[4]。但传统疫苗制备过程复杂，生产条件要求较高，生产过程存在安全风险，以及脱毒剂在发挥脱毒作用的同时对抗原表位有一定的破坏，导致免疫效率低。

优化脱毒方法，尽可能保持免疫原性关键表位的完好，对提高免疫效果具有重要意义。James E K等对脱毒剂浓度、脱毒时间以及是否加入赖氨酸等条件进行研究，表明0.08%甲醛浓度37 ℃脱毒28 d以上可获得免疫原性优良的类毒素[5]。Jones R G等用碘乙酰胺烷基化的方法使B型毒素的毒力降低7个数量级乃至几乎无毒状态，具体方法是用1体积1mg/ml的毒素与3体积新鲜制备的烷基化缓冲液(66.67 mmol/L Tris、1.33 mmol/L EDTA、2.67 mol/L NaCl、2.67 mol/L尿素和266.7 mmol/L碘乙酰胺，pH8.0)混合，37 ℃作用3 h，然后进行透析。该方法制备的类毒素刺激机体产生的中和抗体比甲醛脱毒法制备的类毒素高600倍[6]，小鼠免疫49 d之后，每毫升血清能中和107个LD50的毒素，较甲醛类毒素和重组受体结合域亚单位疫苗(rBoNT-Hc)的免疫反应更快更有效[7]。

2 重组毒素疫苗

随着肉毒毒素的结构、生物活性以及基因突变等方面研究不断深入，有关肉毒中毒症重组疫苗研究成为热点。2.1 受体结合域(Hc片段)疫苗 无毒性的肉毒毒素受体结合域片段(BoNT-Hc)能够有效保护动物模型抵抗相应型毒素攻击，同时又能降低安全风险，被认为是很有潜力的候选疫苗[8]。Yari等[9]原核表达制备了rBoNT/A-Hc，经过对培养基组成、诱导剂剂量、诱导温度及时间等表达条件进行优化，最高获得了52.1 mg/L的可溶性rBoNT/A-Hc。Byrne等[10]在真核毕赤酵母表达人工合成编码BoNT-Hc的基因，纯化后每千克湿细胞可产生纯度超过98%具有免疫原性的rBoNT-Hc蛋白200～500 mg。以弗氏佐剂或铝胶佐剂皮下和肌肉注射免疫rBoNT/F-Hc一次(5 mg)或二次免疫(每次≥0.04 mg)就能够保护小鼠对2×104个LD50的BoNT/F攻击[11]。Yu YZ等[12]证实小鼠二次免疫(每次≥0.2 mg)或三次免疫(每次≥0.04 mg)的rBoNT/A-Hc后均能抵抗106个LD50毒素的攻击。由于BoNT-Hc基因中含较高的A和T不利于原核表达，Zichel等[13]用天然基因在含有蛋白质二硫键异构酶(PDI)以及具有还原或氧化作用的非细胞开放系统(CE)中，直接制备了A、B和E型肉毒毒素Hc片段的融合蛋白，提高了产量，动物实验证实其具有很好的免疫原性。2004年第一个肉毒中毒症重组亚单位疫苗rBV A/B (Pichia pastoris)被用于人体临床试验[14]。在重组嵌合疫苗的研究方面，嵌合了LTB佐剂的C和D型肉毒毒素Hc片段免疫牛，产生的抗体可以分别中和5 IU/mL的C型肉毒素和6.14±1.06 IU/mL的 D型肉毒素，这一效果得到了巴西农业部的认可[15-16]。

2.2 突变型重组毒素疫苗 对A型肉毒毒素的基因E224A/E262A位点进行双基因突变，得到与天然毒素结构相似的无毒性突变型重组毒素，小鼠腹腔注射免疫24.0 μg，用红外(NIR 800)标记检测其在体内的分布情况类似于天然毒素，通过吸入免疫刺激产生的体液免疫和粘膜免疫水平足以使小鼠抵抗天然毒素攻击[17]。

2.3 其他候选亚单位疫苗 罗森和贾宏丽等通过原核表达系统获得了重组A型肉毒毒素轻链(rBoNT/A-LC)，研究证实其具有反应活性和蛋白酶催化活性[18-19]。血细胞凝集素33 (HA-33)是BoNT/A复合体的组成成分，在肠道内对BoNT/A起保护和辅助作用，Sayadmanesh等[20]研究表明，重组HA-33免疫小鼠两周后，用ELISA检测免疫血清，对HA-33的抗体滴度可达1∶128000。但是，能否将这些重组蛋白作为候选亚单位疫苗用于肉毒症的预防还需进一步的试验研究。

3 DNA疫苗

Scott等[21]以单价和三价A、B和E型肉毒毒素受体结合域片段(BoNT-Hc)为靶位，人工合成了DNA疫苗，免疫实验动物后，激活了强大的体液免疫和CD4 T细胞免疫，二次免疫可以实现对机体的完全保护，免疫血清能中和最小致死剂量的毒素。Balb/c小鼠接种了携带BoNT/A-Hc基因的来源于森林病毒(SFV)质粒DNA复制子的疫苗后，AHc和粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)在SFV上共表达，特异性地激活了机体针对AHc的体液免疫和细胞免疫，免疫原性被加强，抗AHc抗体滴度和小鼠对BoNT/A攻击的存活率均显著提高，再经磷酸铝胶佐剂二次免疫，免疫效力得到进一步增强[22]。这些研究结果证明，DNA疫苗可以诱导机体产生免疫保护。

4 展望

许多国家都将肉毒毒素列为食品安全的重要关注对象，同时作为一种生物武器，其也受到了一些军事机构和疾病预防控制中心的重视。因此，一直以来疫苗研究都是这一领域的热点。新型重组亚单位疫苗、突变无毒型疫苗和DNA疫苗可以克服一些传统疫苗的不足，但在提高疫苗抗原含量，保证免疫效果的稳定性，开发有效的免疫佐剂，研究适合产业化的生产技术等方面还需更进一步的探索。在这些新型疫苗中，重组受体结合域(Hc片段)疫苗较其他类型的疫苗研究较为深入，免疫效果也更为确实，是当前和今后可能被应用于临床实践的主要研究方向。随着生物信息技术的发展，利用生物信息技术设计疫苗，模拟机体免疫应答是今后疫苗开发很好的思路。另外，有1/3的天然毒素多肽分子具有通过空气途径被吸入，激活免疫反应，而且这些多肽还可以作为载体分子用于其他病原的吸入免疫[23]，利用这一特点，研制使用更为方便，吸入式免疫的肉毒中毒症疫苗或是其他疾病疫苗对于临床应用将是十分有意义的。

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(编辑：李文平)

Current Status of Research on Botulism Vaccines

PENG Guo-rui, PENG Xiao-bing, LI Xu-ni, DU Ji-ge, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The traditional vaccines included inactivated vaccines and toxoid vaccines, and the new types of vaccines included recombinant subunit vaccines, recombinant chimeric vaccines and DNA vaccines. In order to provide reference for development on botulism vaccines, this paper reviewed the current status of research on these vaccines which had been developed rapidly in recent years.

botulism; neurotoxin; new types of vaccines

彭国瑞，硕士，从事兽用生物制品检验和研究工作。

蒋玉文。E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn

2016-06-03

A

1002-1280 (2016) 09-0066-04

S859.797