高通量测序技术应用于猪病检测的探讨

史子学，王秀杰

（1.上海市嘉定区农业委员会，上海 嘉定 201800；2.北京科高大北农饲料有限责任公司，北京 怀柔 101407）

检测新技术

高通量测序技术应用于猪病检测的探讨

史子学1，王秀杰2

（1.上海市嘉定区农业委员会，上海 嘉定 201800；2.北京科高大北农饲料有限责任公司，北京 怀柔 101407）

高通量测序技术以及全基因组深度测序技术的快速发展，加速了检测技术的更新步伐。文章对高通量测序技术的发展及在微生物检测领域应用进行综述，并对高通量测序技术检测猪病的实践应用进行了分析。

高通量测序技术；猪病；新发和突发传染病

早期确诊并快速清除感染猪是控制猪病的关键，猪病病原体潜伏在猪体内未检出的时间越长，导致传染病扩散的风险就越大。在早期，人们通过典型的临床症状及病理变化即可进行猪病诊断。然而，近30年来，非典型临床病例和混合感染现象越来越多，给猪病诊断增加了难度，单纯的依靠临床症状、病理解剖或仅仅检测个别猪病，已不能对大多数病例做出正确诊断。从养猪业的实际需求来说，一方面对于临床的猪病要求尽量全面的检测出病原种类；另一方面，新发与再现猪病、猪病混合感染的复杂趋势，都对猪病检测提出了更高的要求。

近年来出现的高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称为下一代测序技术，在病原体检测及未知病原体发现方面具有重要意义。高通量测序技术可以实现一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定；覆盖面广，能检测样品中全部遗传信息；准确性高，其准确率可高达99.99%。这为猪病的检测提供了一种重要的检测技术。

1 高通量测序技术的发展

测序技术一直推动着病原学研究的发展，先进的测序技术为病原检测提供了强大的工具。从20世纪90年代开始，Sanger测序法被广泛应用在生物信息学研究当中，并在人类基因组计划（HGP）中发挥了巨大的作用。但由于Sanger测序法通量太低、速度较慢，运用Sanger方法的病原体序列研究受到测序深度的限制，只能了解到病原群体中部分的个体，并且不能全面检测到病原体基因组的数据。而且传统的Sanger测序方法要先构建一个 cDNA文库，然后采用挑选克隆测序的方法，导致实验程序繁琐，且时间和经济成本较高，所以传统的测序法并没有对病原检测技术产生深远影响。

以高通量测序为特点的新一代测序技术具有极高的测序通量、速度快、成本显著降低和高度自动化的优点，广泛应用于基因组测定、表达谱分析、病原微生物检测等海量基因序列的相关研究中[1]。高通量测序与Sanger方法相比被称为深度测序，包括第二代测序和第三代测序技术（基于纳米孔的单分子测序方法），其中第二代测序技术包括基因芯片测序和高通量测序平台。基因芯片测序是在芯片上并行地对可高达百万的DNA 分子进行测序，一次可以产生巨大数据量的测序结果，它显示了测序技术划时代的变革，成为新一代测序技术的重要成员。基因芯片测序方法虽然达到了快速和高通量的标准，但是需要预先知道待测基因的序列制作芯片，其测序灵活性很差，对于研究基因组数据库不完备的物种受到限制。

2 主流的高通量测序技术

以454高通量测序为代表的是目前最具应用前景的第二代测序技术，其克服了先前测序技术的不足，采用边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，尤其适合没有基因组参考序列的物种的基因组或转录组测序。454高通量测序则避免了Sanger测序中涉及的繁重的大量克隆实验，显著减少了工作量和提高了工作效率。454高通量测序技术是现今应用最广泛的测序技术，公认特点是成本低、通量高、速度快，可以快速产生大量的数据。以高通量测序检测环境中微生物多样性流程为例：环境样品提取基因组DNA—16S rDNA高变区ITS PCR富集—构建测序文库—上机测序—得到高质量测序数据—生物信息学分析。目前各个公司研制出了不同的454高通量测序平台，2005年，454公司推出基于焦磷酸测序技术的454测序仪为标志，代表着新一代测序技术的推广和应用。2006年，美国Illumina公司进军新一代DNA测序市场，研发出了测序平台—Solexa测序仪。2007年，美国ABI公司也推出了第二代测序平台—SOLiD测序仪。454 FLX进行测序的片段比较长，高质量的读长可达到400 bp左右，比较适合对未知基因进行全序列的测定。Solexa测序价格低廉，性价比最高，同等条件下成本只有454测序的1/10。且具有全自动化的测序系统，可以读取的片段数目较多，非常适合大量小片度的测序。SOLiD测序对于每个碱基读取两次，准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，15X覆盖率时接近100%。

3 高通量测序在病原体检测领域的应用

虽然各种454高通量测序平台没有达到测序方面的完美，但这几种平台均适合用于临床对病原进行快速、精确地检测，并且此技术在发现未知病原体研究上已显示了技术先进性[2]。高通量测序在医学、环境、食品领域应用较广泛[3]。例如，早产儿通常面对较大的健康问题，有时甚至受到致死性感染，这可能是由于肠道微生物引起的。研究人员利用罗氏454 GS FLX Titanium测序系统对于11例极低出生体重婴儿的肠道样本进行测序，不仅获得了细菌的信息，还有真核真菌和蛔虫的片段。根据检测结果，可以针对性地对这些婴儿使用抗菌素和针对白色念珠菌感染的制霉菌素抗真菌药物等积极治疗手段。此外，最近，挪威和英国的417家养殖场发现一种破坏心脏和肌肉组织，致死率高达20%的心脏和骨骼肌炎症（HSMI）。虽然研究表明这是一种传染病，但研究人员未能鉴定出病原体。美国哥伦比亚大学及挪威国家医学研究所等机构的研究人员组成了一个专门的研究小组，利用罗氏454测序系统的高通量测序技术，发现该疾病是一种与呼肠孤病毒相关的未知病毒感染引起的。借助高通量测序和生物信息学方面的经验，在几周内获得了这种未知病毒的全基因组序列。高通量测序技术可以检测土壤中细菌、真菌、原生动物、病毒及类病毒等微生物的多样性。Sogin等检测深海和未探索的稀有生物圈微生物多样性，454测序结果显示，大西洋海底和热泉中的微生物比先前报道的数据高1～2个数量级，并且微生物类群更丰富。Li等采用454测序技术研究国内酿酒发酵过程中细菌和真菌的多样性，检测到的细菌分属于15个科，真菌分属于6个科，60%的真菌ITS1序列属于酵母科。国内外研究表明，高通量测序平台应用于病原微生物及未知病原体检测具有巨大潜力。

4 高通量测序技术在生猪等养殖业中的应用

Eilliott等通过常规方法研究猪舍空气中微生物，鉴定到存在大肠杆菌、葡萄球菌、弯曲杆菌、革兰氏阴性菌、变形菌、放线菌等。李红梅等[4]使用高通量测序技术检测规模化猪场空气中微生物及其污染传播规律，发现猪舍空气微生物种类多样性，包括有16种门、115种科、217种属，在鉴定的10种优势菌群中，6种为病原微生物，表明高通量测序技术在猪病检测中具有非常大的应用价值。王楷宬等[5]应用高通量测序检测禽类临床样品中未知病原，高效率地发现2种新病毒，并得到该病毒的部分基因组，为后续制定防控策略提供了可靠数据。

5 高通量测序技术检测猪病的应用前景

当前我国猪病流行的新形势及新发、突发猪病的潜在威胁，为高通量测序技术应用于猪病检测提供了现实需求。相比前几年，高通量测序技术的经济成本已经大大降低，对于全面掌握一个猪场或地区猪病的流行背景确实为一种可靠工具，例如，可以对某一地区或猪场病死猪无害化处理冷库中样品，定期用高通量测序技术检测，得到的数据可为当地制定疫病防控策略提供参考，也可作为基础数据上报国家动物疫情测报站。高通量测序技术在应用中也要注意临床样品选择问题，不同的猪传染病的病原体在组织中载量有差别，猪蓝耳病病毒在血液中载量高、猪流感优先检测呼吸道、肛拭子等样品，检测猪瘟则推荐采集扁桃体、肾脏和淋巴结等。如何选择临床样品，有效检测各种猪病需要在临床应用中进一步探讨。

6 结语

高通量测序技术在猪病检测领域的应用，将极大地提高我们对临床样品中猪病混合感染及未知病原的全面认识，对猪病检测、诊断水平带来跨越式的提升。2016年国家重点研发计划项目已发布，2项猪重要疫病的诊断与检测新技术研究获得立项，相信将对猪病检测诊断技术带来进一步的创新性发展。

[1] QUAIL M A, KOZAREWA I, SMITH F,et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system[J].Nat Meth,2008, 5(12):1005-1010.

[2] 李建彬, 庄璐, 安小平,等. 利用高通量测序快速检测疑似感染患者体内未知病原体[J]. 生物信息学, 2011, 9(4):303-306, 313.

[3] 秦楠, 栗东芳, 杨瑞馥. 高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用[J]. 微生物学报, 2011, 51(4): 445-457.

[4] 李红梅, 白林, 姜冬梅,等. 基于16 S rDNA高通量测序方法检测猪舍空气微生物多样性[J]. 畜牧生物技术, 2015, 51(3):81-84.

[5] 王楷宬, 陈贵钱, 蒋文明,等. 新一代高通量测序在禽病毒检测中的应用[C]. 中国畜牧兽医学会家禽学分会第9次代表会议暨第16次全国家禽学术讨论会论文集, 2013.

2016-06-30）

国家自然科学基金青年科学基金资助（31302132）

史子学（1978-），男，博士，研究方向：重大动物疫病防控。