庄金秋,梅建国,张 倩,姚春阳,李 峰(.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东 滨州 56600;.黄岛出入境检验检疫局,山东 青岛 66555)
纳米颗粒技术及其在猪病防治中的应用进展
庄金秋1,梅建国1,张 倩2,姚春阳1,李 峰1
(1.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东 滨州 256600;2.黄岛出入境检验检疫局,山东 青岛 266555)
摘 要:纳米颗粒技术在医学领域已被广泛应用于运载多肽蛋白类药物、输送免疫调节剂、输送疫苗等,具有良好的应用前景。该技术在猪病防治中也已被广泛用于疾病诊断、预防、监测以及治疗等方面。通过综述近年来纳米颗粒技术的最新研究进展,以期为临床更好的防治猪病提供参考。
关键词:纳米颗粒;猪病;防治;进展
纳米颗粒是用纳米级粒子制成的、粒径在10~100 nm范围内的超微粒子。纳米颗粒具有比表面积大、表面活性中心多、反应活性高、吸附和催化能力强的特点,可作为活性组分(药物、活性分子、基因、疫苗等)的载体,通过缓释、靶向输送、提高组分稳定性等方式,延长活性组分在体内的半衰期,并增强其活性。纳米颗粒技术自诞生以来,就因其特殊功效而备受瞩目,成为当前研究的热点,具有良好的应用前景。
医学中的纳米颗粒是一种人工制造的、大小不超过100 nm的微型颗粒。它的形态可能是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒等。非生物原的纳米颗粒一般包括共聚物水凝胶、纳米凝胶、树状分子、碳富勒烯、固体脂质纳米颗粒、纳米乳剂、可生物降解的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)等;生物原的纳米颗粒包括寡核苷酸、多糖以及可作为抗原、变应原、病原体的相关分子模式等[1]。纳米颗粒大小与细胞组分相近,能够利用细胞内吞作用进入细胞。其不仅具有免疫佐剂活性,有助于抗原在细胞内加工,与主要组织相容性复合体(MHC)分子特异性结合、运输并递呈给效应细胞,增强机体产生天然免疫应答,而且还能够通过多种途径到达抗原提呈细胞(APCs),调节免疫应答。在预防性和治疗性疫苗中,纳米颗粒被用作运输系统增加抗原提呈或作为免疫佐剂激活和增强机体产生免疫应答。近年来,随着病毒样颗粒(VLPs)的出现,纳米颗粒技术再次兴起[2]。
2.1 纳米PCR技术
纳米PCR技术是一种新型的PCR技术,其原理为把粒径为1~100 nm的固体纳米金属颗粒悬浮在液体里形成纳米流体。由于纳米流体相对于普通流体具有更强的热导性,所以在添加了纳米金属颗粒的PCR热循环体系中,PCR反应会更快地达到目标温度,减少在非目标温度的停留时间,进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间,最终达到消除非特异性扩增,提高特异性扩增产量的目的。纳米PCR检测方法比常规PCR具有较高的灵敏性、特异性及可重复性,检测结果可靠。
伪狂犬病病毒(PRV)可引起母猪繁殖障碍及初生仔猪大批死亡;成年猪则出现隐性感染,长期带毒排毒,严重影响种猪场生产及优良品种的推广,给养猪业造成极大的损失。控制和消灭猪伪狂犬病所面临的主要困难是确定伪狂犬病病毒的潜伏感染、野毒感染或疫苗感染。马兴杰等(2014)建立了鉴别PRV强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒。对我国黑龙江、吉林等7个省市的117份样品的检测结果显示,PRV强毒阳性率为51%,阴性率为49%,未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义。
猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,衣壳蛋白VP2 是PPV的主要结构蛋白,决定着PPV的组织嗜性、毒力和血凝活性,并且能够诱导机体产生中和抗体。VP2在杆状病毒表达载体系统(BEVS)中能够自我组装成VLPs,是亚单位疫苗研究的首选蛋白。崔宇超(2014)根据VP2蛋白成功构建高效的PPV纳米PCR检测方法,并表明其比普通PCR更加敏感,比荧光定量PCR更加方便快捷。临床上,在PPV感染初期或者后期病毒载量较低时,应用纳米PCR检测PPV能够更加高效,重要的一点是该方法适合于基层实验室的使用。
2.2 新型纳米级吸附剂
史莹华等(2005)应用纳米技术构建了专性高效吸附黄曲霉毒素的纳米级硅酸盐结构微粒(NSP),通过体外和体内试验2个方面研究了NSP对黄曲霉毒素(AF)的吸附,并比较了NSP和普通硅酸盐(SP)的吸附效果,结果表明在黄曲霉毒素污染的日粮(0.l mg/ kg的 AF)中,添加0.3%的NSP,可以极显著地降低黄曲霉毒素在猪肌肉、肝、肾等组织中的残留量;添加0.3% 的SP,有降低猪体组织中黄曲霉毒素残留量的趋势,但效果不明显。NSP之所以具有吸附黄曲霉毒素的显著性能,主要归因于其能选择性吸附和固定动物胃肠道食糜中的黄曲霉毒素,形成稳定的复合体,使之从粪便中排出体外。作为一种新型纳米级吸附剂,NSP的应用无疑为当前生产中普遍存在的黄曲霉毒素污染问题找到了理想、可行的对策,为生产安全的动物产品开辟了一条新途径,为打破动物产品国际贸易中黄曲霉毒素残留限量的技术壁垒提供了科技支撑。
2.3 新型纳米饲料添加剂
史莹华等(2007)以生长肥育猪为试验对象,研究了其构建的特异性高效吸附黄曲霉毒素B1的新型纳米饲料添加剂—蒙脱石纳米复合物(MN)缓解猪黄曲霉毒素中毒症、降低猪体组织中黄曲霉毒素B1残留量的效果。结果表明在黄曲霉毒素B1污染的日粮中添加0.3%的MN,显著降低了黄曲霉毒素B1在猪体组织中的残留量,明显改善了试验猪的生长性能,减轻甚至消除了黄曲霉毒素B1对动物生长性能和肝脏功能等的不良影响。这为纳米级新型饲料添加剂的开发研制奠定了理论基础。
2.4 新型抗病毒材料
银纳米颗粒是运用纳米技术将银元素纳米化后形成的尺寸在1~100 nm的银原子团族,有稳定的化学和物理性能。近年来,银纳米颗粒由于具有优良的抗微生物特性,已逐渐成为人们关注的热点。吕晓楠(2014)以猪传染性胃肠炎作为冠状病毒模型,从细胞水平评价了3种不同的银纳米材料对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染宿主细胞及介导的细胞凋亡的抑制效果。结果表明银纳米材料可有效地抑制TGEV感染细胞,其作用机制是通过灭活病毒亦或阻断病毒侵入细胞。不同质量浓度聚乙烯吡咯烷酮(PVP)表面修饰的银纳米材料具有的抗病毒效果各不相同,这为开发新型抗冠状病毒药物提供了新思路。
2.5 免疫增强剂
纳米硒具有较强的低毒高效优势。在生物功效方面,纳米硒体外清除羟自由基效率为无机硒的5倍,为有机硒的2.5倍。纳米硒对小鼠免疫系统的保护研究已经取得了较理想的结果。武梅等(2005)应用PLGA纳米颗粒包裹pUC18-CpG,研究了阳离子PLGA纳米颗粒和脂质体包裹后的pUC18-CpG对猪副伤寒疫苗接种小鼠免疫系统的体液和细胞免疫应答反应的影响,证明PLGA纳米颗粒包装能显著提高裸CpG质粒的免疫增强活性。陈建林等(2009)制备了包裹猪融合基因PIL-46和CpG基序的真核表达质粒的壳聚糖纳米颗粒,首次开展了猪IL-4和IL-6融合基因和CpG基序协同调节猪对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗免疫应答的研究,结果表明 PIL-46基因和CpG基序经壳聚糖纳米颗粒分子包装后接种实验猪,能够显著增强猪特异抗PRRS体液和细胞免疫应答水平,有效提高接种动物的抗病毒感染能力,促进PRRS的免疫防治。李栋等(2011)研究认为由壳聚糖纳米颗粒(CNP)包裹重组分泌型VR1020质粒(VPIL6C)是猪瘟特异性免疫应答的新型有效免疫增强佐剂。所有这些纳米级颗粒为研制高效安全和效应持久的新型猪用分子免疫制剂增强剂奠定了基础,在加强猪抗传染病的免疫保护中具有广阔的应用潜力。
2.6 纳米佐剂
用纳米颗粒做成的免疫佐剂叫纳米佐剂。纳米佐剂具有特殊的吸收、吸附、控释和缓释性能,具有常规佐剂不可比拟的优势。纳米佐剂包括无机纳米佐剂和有机纳米佐剂。无机纳米佐剂包括纳米氢氧化铝、磷酸钙等;有机纳米佐剂包括壳聚糖及其衍生物、PLGA、蜂胶等。
PRRS在世界范围内的猪场广泛流行, PRRSV的快速遗传突变使现有疫苗无法抵抗新出现病毒株。Li等(2013)评价了多肽纳米纤维水凝胶(H9e)作为PRRSV改性活病毒(MLV)疫苗佐剂的效果。用茵格发PRRSV-MLV疫苗或用H9e免疫佐剂处理的茵格发PRRSV-MLV疫苗免疫猪,然后接种PRRSV父母疫苗株或遗传变异株。结果表明,H9e与PRRSV-MLV疫苗联合使用,能通过改变体液免疫和细胞免疫反应来增强抵抗两种PRRSV病毒株的疫苗效力。
口蹄疫病毒(FMDV)感染偶蹄动物和人引起人畜共患病。杨帆帆(2010)通过机械球磨法将常规粒径的药用活性炭加工成纳米活性炭,通过观察纳米活性炭作为猪口蹄疫O型多肽疫苗的佐剂效果,结果表明纳米活性炭在体外虽存在缓释作用,但是其作为佐剂并没有达到预期的缓释和免疫增强效果。王刚(2010)以牛IL-6基因作为黏膜分子佐剂,吸附壳聚糖PLGA纳米微球载口蹄疫DNA疫苗通过鼻免疫豚鼠,结果表明能够促进口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫。王永林等[3](2010)采用新型纳米佐剂按照不同比例配制口蹄疫O型、AsiaⅠ型双价灭活疫苗,对疫苗的各项指标进行测定,结果表明新型佐剂疫苗黏度低、易注射、稳定性好、安全、免疫副反应小、免疫效果好。唐冬梅等(2015)成功构建了以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型FMDV VP1和VP2基因重组质粒,为O型口蹄疫新型重组基因疫苗的进一步研究奠定了基础。
猪链球菌病对养猪业发展造成极大危害,其中猪链球菌2型(SS2)为人畜共患传染病,严重威胁公共卫生安全。韩芳(2013)以三聚磷酸钠为交联剂,采用离子交联法制备载IgY壳聚糖纳米微粒,采用响应面法优化载IgY壳聚糖纳米微粒的制备工艺,体外释放性能研究结果表明,载IgY壳聚糖纳米微粒具有良好的缓释性能,其在预防和治疗猪链球菌病方面,将具有广阔的应用前景。壳聚糖是一种阳离子多聚糖,来源于甲壳类动物外壳中的甲壳质,是自然界中惟一含游离氨基碱性基的可食性动物纤维,它具有良好的生物相溶性和低毒性及促渗作用,可通过多种方法与抗原分子结合,形成纳米颗粒。壳聚糖纳米颗粒理化特性稳定,且免疫途径多样,具有较好的应用前景。
猪支原体肺炎(MPS),又称猪喘气病,是一种呼吸道飞沫性传染病。赵卓等[4](2009)借助6035纳米佐剂,以改变猪支原体肺炎冻干疫苗的免疫途径,将胸腔注射改为肌肉注射,不仅确保疫苗发挥原有的免疫功效,而且很大程度上可增强疫苗的免疫效果,肺炎减少率均达到80%以上。6035纳米佐剂是采用特殊工艺技术制备的一种新型纳米颗粒佐剂,佐剂中含有免疫增强剂和免疫缓释剂,既可增强药物靶向性,增强疫苗免疫活性,又以延长疫苗的免疫期。
李萍等(2012)研制了一种基于天然多糖纳米凝胶(AP-SS)的新型疫苗佐剂。这种纳米凝胶的主要成分是海藻酸钠,一种存在于褐藻细胞壁中的天然多糖。AP-SS可作为一种安全高效的疫苗载体和佐剂,全面提高疫苗诱导的细胞免疫和体液免疫。李树鹏(2012)以纳米乳给药系统为载体,对中药黄芪多糖进行剂型改造,研制出黄芪多糖纳米乳(APS-NE)给药系统。纳米乳是目前研究较多的一种疫苗佐剂。它是一个由油、水、表面活性剂、助表面活性剂4个组分组成的、粒径在10~100 nm范围、液滴多为球形,大小均匀,透明或半透明、具热力学稳定和各向同性、热压灭菌和高速离心稳定,不分层的胶体分散系统。纳米乳作为一种新型药物载体,具有众多其他药物载体无可比拟的优点,使其在药剂学领域中显示出诱人的发展前景,应用日益广泛。
赵卓等(2008)分别采用新型纳米佐剂和传统白油佐剂配制猪伪狂犬病灭活疫苗,对两组疫苗进行各项指标测定,结果表明新型纳米佐剂疫苗具有稳定性高,黏度低,吸收良好,免疫副反应小等优点,免疫增强效果明显优于白油佐剂。郭沛等[5](2012)研究了纳米磷酸钙(NCaP)作为猪瘟多肽疫苗佐剂的可行性,其利用猪瘟多肽疫苗作为抗原,制备纳米磷酸钙吸附猪瘟多肽疫苗。结果表明,NCaP作为佐剂相对游离猪瘟多肽可提高其免疫效果。徐卫松等(2014)研究表明以纳米二氧化硅为佐剂制备的猪传染性胃肠炎(TGE)灭活疫苗能显著提高机体的免疫水平,并能刺激机体更快地产生有效抗体,且抗体水平持续时间较长,并能在一定程度上增强猪传染性胃肠炎灭活疫苗的细胞免疫强度,具有较好的免疫保护效果。寇亚楠等[6](2015)研究认为以纳米铝胶为佐剂制备的猪细小病毒灭活疫苗,能显著提高机体的免疫水平,并较早刺激机体产生抗体,具有较好的免疫保护效果。
2.7 纳米颗粒疫苗
近年来,通过化学或基因方法修饰过的病毒纳米颗粒作为潜在的优秀载体运输工具和免疫增强剂已被广泛应用到多个方面[7]。采用纳米技术所制成的携带各种疫苗并能精确释放的微芯片或是包裹、表面结合疫苗的纳米粒子只要一次性植入畜禽体内,就可终身对各种传染病产生免疫。不但可以避免现行因多次免疫接种给机体造成的应激而给生产带来损失,而且大大提高了免疫效果,彻底改变了现行免疫方法的程序。纳米颗粒疫苗不仅能够提高抗原的稳定性、增强抗原的递呈和免疫原性,同时也能够靶向性递呈抗原和缓慢释放。张建远(2009)成功构建了猪圆环病毒2型(PCV2)核酸疫苗,并使用壳聚糖对核酸疫苗进行了包被,为研制新型、高效、安全的PCV2核酸疫苗及测定评价猪细胞因子分子免疫佐剂提供了理论依据。欧阳康(2013)首次将荆豆凝集素(UEA)与二乙烯亚胺(BEI)灭活的PRRSV病毒抗原包埋到PLGA纳米颗粒中制成疫苗,结果显示同时包埋UEA与抗原的PLGA纳米颗粒疫苗比单独只包埋抗原的效果好。
纳米颗粒技术是一门具有广阔前景的新兴技术,纳米技术与免疫技术相结合的产物—纳米佐剂已成为了当前疫苗研究的热点。利用不同形式的纳米佐剂可以通过多种途径提高肿瘤疫苗的免疫效应和治疗效果。纳米佐剂作为疫苗递送系统能够模拟病原体的一些关键特征,如大小、形状、表面性质等,从而激发机体的免疫功能。目前对纳米佐剂的研究已经取得了一定的成果,但大多数还处于试验阶段,还存在许多问题没有解决,如很难合成具有物理性质一致的纳米颗粒,缺乏对纳米颗粒的物理性质是如何影响其生物分布和定位的基本认识,以及这些特性如何影响它们与生物系统之间的相互作用等,离临床应用还有一定的差距[8]。但是,随着纳米生物技术的发展和研究的深入,借助生物纳米材料为疫苗载体和佐剂系统的研制提供的契机和思路,相信开发更加高效、安全、稳定的兽用新型疫苗和疫苗佐剂将指日可待。
参考文献
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[6] 寇亚楠,刘石,王瑞宁,等. 纳米铝胶佐剂增强猪细小病毒灭活疫苗猪体免疫的效果[J]. 中国兽医学报,2015,35(1):25-30.
[7] 李凯,张金玲,王倩,等. 病毒纳米颗粒在医学领域的潜在应用[J]. 生物医学工程学杂志,2014,31(3):718-722.
[8] 李鹏,郭军庆,李清州,等. 纳米颗粒疫苗研究进展[J]. 河南农业科学,2014,43(4):21-25.
收稿日期:(2015-07-22)
作者简介:庄金秋(1978-),女,山东潍坊人,兽医硕士,副研究员,主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。
基金项目:山东省重点研发计划项目(2015GSF121027);山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-06-022-15)