疫苗研究 猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状

李国新，童 武，郑 浩，童光志（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）



疫苗研究猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状

李国新，童 武，郑 浩，童光志*
（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生较为严重，是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国于20世纪70 年代从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株，自20世纪90 年代以来国内规模化猪场普遍使用该基因缺失疫苗，使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是，自2011年以来，一种由伪狂犬病毒变异毒株引起的猪伪狂犬病在我国暴发，造成母猪繁殖障碍和初生乳猪死亡，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1-4]。针对新出现的伪狂犬病毒变异毒株，国内多家研究机构对其基因特征、抗原性和致病性等进行了一系列的研究，并在此基础上，开展了疫苗的研制工作。

1 伪狂犬病毒变异毒株的基因特征

通过对伪狂犬病毒的全基因组以及各基因序列进行比较分析，发现我国分离的伪狂犬病毒基因序列与国外（主要是欧洲及美洲）分离的毒株序列存在显著的差异，系统发育分析进一步表明中国的分离株与国外的分离株进化关系较远，形成两个不同的基因型。病毒毒力相关基因比较分析显示，我国新出现的变异毒株与国内早期经典毒株Ea株和Fa株存在一定的遗传差异，不过这些差异对病毒毒力和感染特性的影响还需要进一步研究[5]。

2 伪狂犬病毒变异毒株致病性分析

与经典的伪狂犬病毒强毒株相比，伪狂犬病毒变异毒株对小鼠和猪的致病力明显增强。我们的研究进一步证实，对于15日龄、30日龄和60日龄的猪，伪狂犬病毒变异毒株感染猪发病更快，临床症状和病理变化更严重，死亡率也更高。而且，感染猪的临床表现与猪的日龄、毒株的毒力以及接种剂量密切相关[6]。

3 伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）和变异毒株的抗原性差异

Bartha-k61株诱导的中和抗体对变异毒株的中和能力远低于对Bartha-k61 株或经典强毒株的中和能力。而变异毒株诱导的中和抗体对变异毒株和Bartha-k61株都具有较高的中和能力。表明伪狂犬病毒变异毒株与传统疫苗株及经典强毒株的抗原性存在一定的差异。对于伪狂犬病毒变异毒株的攻击，猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）对接种羊只能提供50%的保护；而对于经典伪狂犬病毒强毒株的攻击，则提供了100%的保护。同样，对于伪狂犬病毒变异毒株的攻击，Bartha-K61株对接种猪只能提供部分保护[7]。伪狂犬病毒变异毒株增强的毒力与抗原性变化可能是导致疫苗免疫猪场发生猪伪狂犬病的重要原因。

4 猪伪狂犬病疫苗研制现状

对于新出现的伪狂犬病毒变异毒株的侵袭，传统的伪狂犬病疫苗已不能提供完全的保护。感染猪场伪狂犬病毒gE 抗体阳性率显著升高，并伴有母猪繁殖障碍和初生乳猪死亡。因此，针对伪狂犬病毒变异毒株，国内多家研究机构开展了疫苗的研制工作。

4.1 猪伪狂犬病基因缺失活疫苗的研制

4.1.1 猪伪狂犬病双基因缺失疫苗候选毒株 中国农业科学院上海兽医研究所利用同源重组技术把伪狂犬病毒变异毒株（JS-2012株）进行基因缺失，构建了gE和gI双基因缺失的伪狂犬病毒（JS-2012-△gI/gE株）。该毒株接种11日龄仔猪不引起任何临床症状，而且该毒株不能水平传播和垂直传播，安全性良好。用105.0TCID50的JS-2012-△gI/gE株肌肉注射或鼻腔接种4周龄仔猪，能诱导高水平的中和抗体，并能使接种猪完全抵抗伪狂犬病毒变异毒株（JS-2012株）的攻击。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所利用同源重组技术把伪狂犬病毒变异毒株（TJ株）进行基因缺失，构建了gE和gI双基因缺失的伪狂犬病毒（rPRVTJ-delgE株）。该毒株在PK-15细胞上的增殖滴度低于其母源毒株（TJ株），但与疫苗株（Bartha-K61株）无明显差别。用103、104和105TCID50的rPRVTJ-delgE分别接种6周龄仔猪，7天内没有观察到临床反应，也没有检测到病毒排出。接种后第7天用伪狂犬病毒变异毒株（TJ株）攻击，所有的接种猪都得到了保护。在攻毒前，即使没有检测到中和抗体的仔猪，也能抵抗强毒的攻击[7]。这提示，伪狂犬病毒双基因缺失毒株可以快速激发机体免疫应答，使接种猪能抵抗强毒的攻击，而这种保护与中和抗体水平并无必然的联系。

4.1.2 猪伪狂犬病三基因缺失疫苗候选毒株 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在双基因缺失毒株（rPRVTJ-delgE株）的基础上，进一步缺失了TK基因，构建了三基因缺失的伪狂犬病毒（ rPRVTJ-delgE/ gI/TK 株）。实验证明，该毒株安全性与免疫原性良好[8]。国家兽用药品工程技术研究中心利用细菌人工染色体技术（BAC）把伪狂犬病毒变异毒株（HN1201株）进行了基因缺失，构建了TK、gE和gI三基因缺失的伪狂犬病毒（vPRV HN1201TK-/gE-/gI-株）。与母源毒株（HN1201株）相比，三基因缺失毒株（vPRV HN1201TK-/gE-/ gI-株）在Vero细胞上有相似的生长特性，基因缺失对病毒在Vero细胞上的增殖没有产生大的影响。用107TCID50的vPRV HN1201 TK-/gE-/gI-鼻腔接种9日龄仔猪，没有观察到临床反应。4周后，用107TCID50的伪狂犬病毒变异毒株（HN1201株）攻击，对照组猪全部死亡，而免疫组猪除了个别猪有一过性的发热外，没有表现出其他任何临床症状[9]。华中农业大学利用同源重组技术把伪狂犬病毒变异毒株（SMX株）进行基因缺失，构建了TK、gE和gI三基因缺失的伪狂犬病毒（rSMX△gI/ gE△TK株）。该毒株接种1日龄仔猪不引起任何临床症状，哨兵猪也一直保持伪狂犬病毒抗体阴性。用106.0TCID50的rSMX△gI/gE△TK肌肉注射接种3周龄仔猪，能诱导高水平的中和抗体，并能使接种猪完全抵抗伪狂犬病毒变异毒株（SMX株）的攻击[10]。

4.2 猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗的研制

4.2.1 猪伪狂犬病单基因缺失灭活疫苗候选毒株 国家兽用药品工程技术研究中心利用同源重组技术把伪狂犬病毒变异毒株（HN1201株）进行了基因缺失，构建了gE基因缺失的伪狂犬病毒（HN1201△gE株）。该毒株在PK-15上的生长特性与母源毒株（HN1201株）没有明显差别。利用该毒株制备的灭活疫苗免疫3周龄仔猪，免疫后1周检测到了中和抗体。4周后，用107TCID50的伪狂犬病毒变异毒株（HN1201株）攻击，对照组猪全部发病并死亡，而免疫组猪只是在攻毒后4天内有一过性的发热，没有表现出其他任何明显的临床症状[11]。

4.2.2 猪伪狂犬病双基因缺失灭活疫苗候选毒株 中国农业科学院上海兽医研究所利用构建的gE 和gI双基因缺失毒株（JS-2012-△gI/gE株）进行了猪伪狂犬病灭活疫苗的研制。该灭活疫苗高剂量接种2周龄仔猪，不引起任何临床不良反应，不影响仔猪的生长。用该灭活疫苗高剂量接种妊娠约45日左右的母猪，不引起任何临床不良反应，也不影响母猪的生产性能。该灭活疫苗免疫仔猪能产生高水平的中和抗体，并能抵抗伪狂犬病毒变异毒株（JS-2012株）的攻击。该灭活疫苗免疫妊娠母猪，可以使初生仔猪获得被动免疫保护。南京农业大学利用细菌人工染色体技术（BAC）把伪狂犬病毒变异毒株（ZJ01株）进行了基因缺失，构建了gE和gI基因缺失的伪狂犬病毒（vZJ01△gE/gI株）。把伪狂犬病毒（vZJ01△gE/gI株）灭活后制备成灭活疫苗，免疫4周龄仔猪，能够诱导产生针对变异株的中和抗体。第二次免疫后3周用106TCID50的伪狂犬病毒变异毒株（ZJ01株）攻击，对照组猪全部死亡，而免疫组全部保持健康[12]。

总之，对于新出现的伪狂犬病毒变异毒株，国内的研究机构做了大量的工作。对伪狂犬变异毒株的基因特征、抗原性以及毒力等生物学特性有了初步的认识，这对疫苗的研制提供了良好的基础。无论是活疫苗还是灭活疫苗，猪伪狂犬病疫苗的研究策略都以基因缺失毒株作为疫苗候选毒株，这样既降低了疫苗候选毒株的毒力，还有利于利用血清学方法对疫苗接种猪和野毒感染猪进行鉴别诊断。目前，针对新出现的伪狂犬病毒变异毒株，国内的研究机构正在加紧研制猪伪狂犬病基因缺失活疫苗或灭活疫苗，并进展顺利。在不久的将来，一批优良的疫苗就会从实验室走向市场，为伪狂犬病的控制甚至根除做出贡献。

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收稿日期：（2016-01-07）

*通讯作者，gztong@shvri.ac.cn

基金项目：上海市青年自然科学基金（14ZR1448900)和上海市农委科技兴农项目资助（沪农科攻字（2015）第1-7号）