当归补血微囊胶原海绵促进伤口愈合的效果观察

陈海军，潘立群

(南京中医药大学 1.第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.附属昆山市中医医院肿瘤外科，江苏 昆山 215600)

当归补血微囊胶原海绵促进伤口愈合的效果观察

陈海军1, 2，潘立群1

(南京中医药大学 1.第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.附属昆山市中医医院肿瘤外科，江苏 昆山 215600)

当归补血汤是补气生血代表剂。黄芪甲苷和阿魏酸分别是黄芪和当归中代表性的活性成分[1-2]。胶原蛋白海绵作为生物支架材料，可止血及促进组织愈合，可体内降解、组织相容性好[3]，将药物微囊化后与胶原海绵相结合，可以形成更长效的缓控释制剂。本实验中，当归补血微囊以当归补血汤为原型，以黄芪甲苷和阿魏酸5:1配比，制成微囊后混合吸收进入胶原海绵[4]，通过建立大鼠损伤模型，探讨当归补血微囊胶原海绵促进伤口愈合的作用。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠，♀♂各半，体质量(230±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要药品与试剂 医用胶原蛋白海绵，无锡贝迪生物工程有限公司。黄芪甲苷微囊、阿魏酸微囊、当归补血微囊及空白微囊胶原海绵均由南京中医药大学中药药剂教研室提供。

1.3 主要仪器 显微镜，BX43型，OLYMPUS公司；电泳系统，Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司；凝胶成像仪，ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司；OD值测量仪器，高精度分光光度计，Merinton SMA4000；定量PCR仪，CFX connect Real-Time PCR System。

2 方法

2.1 SD大鼠损伤模型的建立 纵行切开麻醉大鼠背部皮肤全层，皮下形成2 cm×2 cm的口袋，建立SD大鼠损伤模型。各组大鼠分别于背部左右侧各置入相应的2 cm×2 cm微囊无菌胶原海绵，缝合切口。

2.2 动物分组给药及标本采集 60只SD大鼠，♀♂各半，随机分为模型对照组(仅无菌胶原海绵)、阴性对照组(含空白成囊材料)、阿魏酸组(含阿魏酸微囊12.5 μg)、黄芪甲苷组(含黄芪甲苷微囊62.5 μg)和当归补血微囊组(含阿魏酸12.5 μg、黄芪甲苷62.5 μg制成混合微囊)。造模14 d后处死大鼠，取微囊胶原海绵周围肉芽组织进行检测。

2.3 指标的检测

2.3.1 病理学检测 肉芽组织HE染色、CD34染色和masson染色。

2.3.2 Western blot检测p-STAT3、VEGF蛋白表达 常规方法提取肉芽组织总蛋白，一抗分别为磷酸化兔抗人STAT3单克隆抗体和兔抗人VEGFA多克隆抗体，二抗为羊抗兔Ig G，ECL化学发光显影，分析各条带光密度。

2.3.3 VEGF mRNA以及miRNA表达检测 提取各组肉芽组织总RNA进行逆转录反应。实验结果由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动进行统计和计算。

3 结果

3.1 当归补血微囊胶原海绵对创伤大鼠伤口愈合的影响 HE染色结果显示，当归补血微囊组肉芽组织血管及成纤维细胞大量增生，且明显增生活跃。CD34染色结果显示，黄芪甲苷组、阿魏酸组和当归补血微囊组微血管计数均高于模型对照组和阴性对照组(P<0.01)。masson染色结果显示，3个微囊给药组胶原纤维密度均匀，排列有序。

3.2 当归补血微囊胶原海绵对创伤大鼠肉芽组织p-STAT3、VEGF蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，当归补血微囊组肉芽组织中p-STAT3、VEGF表达较模型对照组和阴性对照组均明显增加，可见当归补血微囊可激活STAT3和VEGF，从而诱导新生血管形成。

3.3 当归补血微囊胶原海绵对创伤大鼠肉芽组织VEGF mRNA以及miRNA-21基因表达的影响 RT-PCR检测结果显示，与模型对照组比，黄芪甲苷组可提高VEGF mRNA的转录水平，当归补血微囊组可明显提高VEGF mRNA的转录水平；黄芪甲苷组和当归补血微囊组均可明显上调miRNA-21的转录水平。

4 讨论

创面修复愈合是一个连续的复杂过程，肉芽组织形成是创面修复愈合的关键步骤之一，而肉芽组织的本质是毛细血管和成纤维细胞[5-6]。本实验从整体动物层面中HE染色肉芽组织增生情况、CD34标记的微血管数量、masson染色胶原纤维生成情况，蛋白层面中STAT3蛋白磷酸化水平和VEGF水平，以及基因层面中VEGF mRNA和miRNA-21的表达等不同层次递进展开。综上所述，当归补血微囊可以促进肉芽组织血管及成纤维细胞大量增生，促进创面毛细血管生成，促进胶原纤维生成，进而促进肉芽组织生成，实现其促进损伤模型大鼠伤口愈合的作用，其作用机制可能是通过激活STAT3和VEGF蛋白表达，上调VEGF mRNA和miRNA-21基因转录水平。

[1] 秦 臻, 黄水清. 当归补血汤含药血清对内皮祖细胞功能及其PI3K/Akt通路影响的研究[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(9): 1320-3.

[1] Qin Z，Huang S Q. Influence of drug-serum containing Dangguibuxue decoction on functional activity and PI3K/Akt pathway of endothelial progenitor cells[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(9): 1320-3.

[2] 董海燕, 杨建刚, 肖志强, 等. 4种中药和3个方剂促血管新生作用及有效组分的研究[J]. 中药材, 2013, 36(8): 1297-300.

[2] Dong H Y，Yang J G，Xiao Z Q, et al. Pro-angiogenic effects of four chinese medicines and three herbal prescription in chicken chorioallantoic membrane model[J].JChinMedMater, 2013, 36(8): 1297-300.

[3] 周 勇, 任伟业, 邵大畏, 等. 胶原海绵促进创面止血与血管新生的实验研究[J]. 湖南中医杂志, 2012, 29(3): 140-1, 65.

[3] Zhou Y, Ren W Y, Shao D W, et al. Experiment research on collagen sponge promote wound bleeding and angiogenesis[J].HunanJTraditChinMed, 2012, 29(3): 140-41, 65.

[4] 张 越, 陈 军, 潘自皓, 等. 当归补血汤活性成分植入剂的研究[J]. 时珍国医国药, 2015, 26(12):2916-9.

[4] Zhang Y, Chen J, Pan Z H,et al. Preparation and release rate determination of sustained-release formulation containing multicomponents from TCM[J].LishizhenMedMaterMedRes, 2015, 12(26): 2916-9.

[5] 赵光明. 回阳生肌膏对糖尿病皮肤溃疡大鼠血管生成相关因子影响的实验研究 [D]. 北京中医药大学, 2014.

[5] Zhao G M. Experiment research on angiogenesis related factor in diabetic skin ulcer rats with Huiyang shengji plaster[D]. Benjing Univ Chin Med, 2014.

[6] 郭勇英, 张军芳, 贾存勤, 等. 通心络联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠血管新生HIF-1/VEGF通路及miR-210表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2015，31(12): 1749-54.

[6] Guo Y Y, Zhang J F, Jia C Q, et al. Treatment effect of Tongxinluo combined peripheral blood derived mesenchymal stem cells transplantation on angiogenesis of HIF-1/VEGF pathway and miR-210 in diabetic foot rats [J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(12): 1749-54.

Effect observation of collagen sponge with Angelica microcapsules for replenishing blood to promote wound healing

CHEN Hai-jun1,2, PAN Li-qun1

(1.TheFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2.DeptofOncosurgery,TraditionalChineseMedicineHospitalofKunshanAffiliatedtoNanjingUniversityofChineseMedicine,KunshanJiangsu215600,China)

当归补血微囊；胶原蛋白海绵；伤口愈合；HE染色；CD34染色；masson染色；STAT3；VEGF；miRNA-21

Angelica microcapsules for replenishing blood; collagen sponge; wound healing; HE staining; CD34 staining; masson stain; STAT3; VEGF; miRNA-21

时间：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.056.html

2016-08-11,

2016-09-27

国家自然科学基金资助项目(No 81373534);高等学校博士学科点专项科研基金项目(No 20123237110003)

陈海军(1964-)，男，博士生，主任医师，研究方向：肿瘤外科，E-mail：ksschj@126.com； 潘立群(1949-)，男，教授，主任中医师，博士生导师，研究方向：中医外科，通讯作者，E-mail：cr_ane@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.028

A

1001-1978(2016)12-1775-02

R-332；R282.71；R289.5；R64