蚕丝及其衍生材料在运动损伤修复中的应用

汪斯衡 蒋佳 陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

蚕丝及其衍生材料在运动损伤修复中的应用

汪斯衡 蒋佳 陈世益

复旦大学附属华山医院运动医学与关节镜外科（上海 200040）

蚕丝作为古老的生物材料，在纺织及医学中已有广泛应用，而近年来新技术新工艺的发展也为其在组织修复，尤其是运动损伤修复中的应用带来新的可能，其强度和生物相容性也提示了其在硬组织修复中的可能性。本文综述了蚕丝的生物特性及其分子生物学基础，并总结了新工艺的产生为其在组织修补方面带来的可能性。

蚕丝；组织修补；生物力学；生物相容性

蚕丝作为人类最早使用的自然高聚物，已经有3.8亿年左右的历史。蚕丝长久以来就被用于服装、纺织等各方面，由于其独特的强度、疏水性以及色泽等，其织物一直深受欢迎。近来，不少研究注意到其在强度、亲水性等各方面的独特性质并将其用于组织修复。在运动损伤的修复中，蚕丝及其衍生物的运用在近几年取得了许多成果。本文着重说明蚕丝其特性在组织修复中的优势以及蚕丝和其衍生物在运动损伤修复中的新成果。

1 蚕丝的特性

蚕丝具有良好的延展力，也具有高度的抗张能力。以家蚕的蚕丝为例，受到张力时，其延展程度可以达到全长的18%，能够承受的最大张力可以达到0.6 GPa，强度可达70 MJ·m-3[1]。同时具有如此大的延展性和抗张性是绝大多数人工合成材料无法达到的。其延展性目前比较公认的原理是其中纳米纤丝的排列可在受力下发生改变，并且能够在不受力时恢复原状[2]。其力学强度目前比较公认的原理是丝素蛋白中大量存在的β片层二级结构，这些结构排列整齐，其间具有较强的相互作用[3]。

由于蚕丝蛋白固有的物理特性与其二级和三级结构密切相关，所以其制备也有一定的要求。人工生产蚕丝需要先将蚕丝溶解制备成水溶液，经过脱水、酸化、结晶等工序完成。其中涉及到的一个重要步骤是如何使水溶液中具有α螺旋二级结构的丝素蛋白结晶化（crystallize）形成β片层结构。这涉及到晶核形成以及聚集生长两个时相，一些金属离子，如钾离子和铜离子在这一过程中起到重要作用[4]。

自然的蚕丝产生过程存在两个相间的转变，第1个相是粘性水溶液相，此时的丝素蛋白处于从无序到有序变化的过程中，二级结构以α螺旋为主。第2个时相为晶化相，其特点是晶格排列规整，具有疏水性，二级结构以β片层为主[5]。由于两个时相截然不同的物理性质，其后的生物应用也受此启发分为两个不同的方向，一是运用晶化相为主的应用，主要利用其强度和延展性；二是运用水溶液相为主的应用，主要利用其亲水性和生物相容性。

蚕丝在体内的降解主要通过蛋白水解和长期逐渐吸收这两个方式实现[6]。蚕丝在体内降解所需时间超过60天，因此属于非降解材料。据估计蚕丝纤维在体内1年内会丧失大部分抗张力，在体内2年后就无法在原移植处检测到。蚕丝在体内的降解受到患者健康状况、蚕丝类型，蚕丝直径以及其二级结构的影响。然而由于体内实验受伦理等多方面限制，这些因素对蚕丝降解的具体影响尚未完全阐明。Horan等[7]在体外运用蛋白酶XIV对家蚕丝进行70多天的降解实验，发现酶可以降解溶于水里的丝素蛋白，但无法降解成片的丝素蛋白，这可能是由于二级结构及三级结构的折叠将酶切位点保护起来使其无法与酶接触。这也解释了蚕丝在体内需要较长时间降解的原因。Liu等[8]发现蚕丝植入皮下7天后开始降解，而在145天后皮下植入处仍可发现未降解的蚕丝。

2 蚕丝及其衍生材料在运动损伤修复中的作用

蚕丝由于其良好的生物力学特性，在自然界的可得性以及可预测的较长的降解时间，在生物医学应用方面已经具有很长的历史。多年来，家蚕丝已被成功用

作缝线，但是一直有报道这样的缝线会造成由巨噬细胞引起的炎症反应[9]。过去普遍认为蚕丝的丝胶会导致过敏反应[10]，而最近的研究则表明单独的丝胶或丝素并不会引起过敏反应[11，12]，只有二者结合在一起时才会引起过敏反应。因此要避免过敏反应只需单独应用其中一种组分即可。由于在结构上丝素纤维是蚕丝的核心，且在蚕丝的力学性能中发挥了重要作用，而丝胶在蚕丝的力学性能中作用不大，所以通常将蚕丝脱胶后使用丝素蛋白，以获得良好的生物相容性[13]。

2.1蚕丝直接用于组织修复

脱胶后的丝素蛋白单丝可制成多种扭曲的结构，包括绳状、缆状，纺成纱状用于组织修复[14]。Altman等[14]运用蚕丝脱胶得到的单丝，经过编织缠绕构建了人工前交叉韧带，其在轴向上有一定的力学强度和延展性。Gellynck等[15]发现蚕茧直接进行脱胶处理后得到的基质上有人软骨细胞的长入，其长入率与孔隙的多少有关。Fan等[16]把兔骨髓间充质来源干细胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）种植在丝素支架上体外培养8 h后移植重建兔的ACL，术后8周、16周和24周时，大体观察、组织学观察和力学测试的结果均优于无BMSCs的丝素支架对照组。随后Fan等[17]在猪的ACL重建实验中也得到了相似的结果。这些结果较为确切地证实了蚕丝良好的组织相容性。

2.2丝素蛋白膜

丝素蛋白膜可以通过多种工艺来制作，目的是为了改善其表面特性以及机械强度[18，19]。由于膜内成骨是骨组织再生修复的重要方式之一，而丝素蛋白又具有一定的强度和生物相容性，不少研究尝试利用丝素蛋白膜为较大骨组织缺损的修复提供支撑条件。Meinel等[20]制作了一种基于丝素蛋白的可植入片状支架用以修复小鼠巨大颅骨缺损，结果发现术后5周组织工程骨组（以丝素蛋白为支架，负载细胞因子以及人间充质来源干细胞）的X线片出现较为明显的矿化，相比之下单纯丝素蛋白组未出现明显矿化。这一结果也与组织切片的结果相符。他们认为单纯的丝素蛋白膜支架只能提供一个宿主增殖的合适环境，长入的细胞缺少向成熟成骨细胞分化的倾向。与之相对，若干在兔颅骨缺损模型中的研究发现丝素蛋白膜能够有效地促进骨缺损处的骨再生[21，22]。

在丝素蛋白膜促进骨质再生模型中最有争议的问题是丝素蛋白本身是否能够促进成骨细胞分化信号的表达，这也是骨组织工程应用中的重要问题之一。Miyamoto等[23]的研究显示，丝素蛋白可以触发成骨细胞早期及晚期分化信号的表达。如成骨细胞在和丝素蛋白接触后的前14天内I型胶原蛋白基因（Col1a1）的表达水平升高，而在40天后骨钙素（osteocalcin）以及骨调节素（osteomodulin）的mRNA水平增加。Jones等[24]也报道丝素蛋白能够支持成骨细胞的粘附和增殖，同时也能促进破骨细胞的粘附和分化。虽然这些研究结果显示丝素蛋白膜在骨组织工程应用中的潜力，但用矿化成分或其他高聚物对丝素蛋白进行改良应该能改善其成骨能力，有更广的应用前景。

2.3水凝胶

丝素蛋白水凝胶是再生丝素蛋白溶液在酸性环境下，有脱水剂存在，具备一定的离子条件，经声学处理和冻干处理后经由溶-胶转变得到的[25，26]。这一过程可以通过提高蛋白浓度，提高温度，添加钙离子加快[27]。丝素蛋白水凝胶不溶于水，有着多孔网状结构，被广泛用于生物医学材料，如人工皮肤、接触性镜片、给药系统等，是当前研究的热点[28]。人造软骨是丝素蛋白水凝胶的重要应用领域。经水凝胶技术形成的丝蛋白支架相较胶原蛋白支架能使软骨组织形成更稳固、更同质的结构，相较胶原蛋白支架，其生物降解率更低，并且不需要其他有机溶剂就能被生产出来[29]。Chao等[30]观察到丝素蛋白水凝胶基质上形成的软骨在机械特性和生物化学特性上都与琼脂糖上形成的软骨相似。这提示丝素蛋白水凝胶可作为一个可降解支架运用于组织修复。Hofmann等[31]将人类骨髓来源的间充质干细胞种植于一系列支架上，结果发现丝素蛋白水凝胶支架上的细胞增殖速率较胶原支架更高，同时丝素支架上软骨粘多糖的沉积也更为均质。Diab等[32]将静电纺丝PCL纳米纤维管和丝素蛋白水凝胶构成一个给药系统，用于大鼠股骨粉碎性骨折模型中骨成型蛋白-2（BMP-2）的给药，给药系统使模型取得了更好的成骨效果。Etienne等[33]也报道丝蛋白水凝胶上种植的成纤维细胞能够增殖并且合成蛋白，组织分析显示，将这一复合体植入皮下30天后可有血管长入。以上这些研究均提示，经水凝胶技术处理的丝素蛋白具有良好的生物相容性，并且有助于细胞附着生长，是良好的组织修复材料。

2.4丝素蛋白支架

如前所述，将丝素蛋白制作成多孔海绵状结构是目前认为较好的生物材料结构，因为这样的结构能够较好地模仿体内的微环境，有利于细胞附着生长[28，34]。形成这种多孔海绵状结构的方法有静电纺丝[34]和水凝胶技术[22]等。

随着丝素蛋白支架在骨和软骨组织工程领域应用的增加，其机械强度成为人们关注的问题。为得到具有更好机械强度和生物结局的材料，人们常将无机[35，36]或有机[37]的填充物添加入材料制成混合丝蛋白3-D支架，以获得更好的机械强度和生物相容性。通常填充物是在支架制作过程中添加以保证其同质性，然而也有

在支架制作完成后加入填充物颗粒的报道[35]。混合配方设计的难点在于两种成分之间的相容性，否则会造成混合不均、相分离以及组织副反应等结局[38]。丝-丝混合支架是高强度丝蛋白3-D支架的代表之一，Rajkhowa等[39]将碾碎的丝蛋白颗粒混入多孔的丝蛋白海绵中，这一处理显著地提升了材料的抗压性，从不足50 kPa提升到了约2.2 MPa。作为改进，Mandal等[40]将长度为10～600 μm的丝素蛋白纤维添加入多孔3-D支架中加强其抗压能力，使抗压能力达到13 MPa。

在丝素蛋白支架中混入各种成分以改善其生物特性已成为近年研究的热点。Chen等[41]将人类胚胎干细胞来源的间充质干细胞（hESC-MSC）结合于丝蛋白-胶原蛋白海绵支架上，研究其促腱组织生长能力，结果发现腱组织能够均匀地长入支架中，并有一定的强度。Jiang等[36]用将羟基磷灰石添加入水凝胶的方法建立了再生丝素蛋白支架，证明支架能够在体外增强骨髓来源的间充质干细胞的成骨能力，为骨组织修复提供了依据。Fan等[42]用蚕丝纤维强化了明胶/丝素蛋白杂交支架，并且将间充质干细胞培养于其上，结果发现种植于杂交支架上的MSC具有更高的增值率和DNA含量，MSC在支架上分布均匀，并且也可检测出软骨相关胶原蛋白的表达，证明MSC在支架上可以向成纤维细胞分化。

2.5丝素蛋白颗粒

再生丝素蛋白微粒可以将丝素蛋白溶液经多种工艺加工而成，如冻干粉碎技术、喷涂干燥技术、喷射粉碎技术、自组装技术以及冷冻解冻技术等[18]。与之相对，碾磨丝素蛋白颗粒可以直接由丝素蛋白纤维碾磨而成，不需要经过化学溶剂处理[39]。由于得到的颗粒在显微结构上存在巨大的差别，因此碾磨得到的丝素蛋白颗粒主要用于填充3-D丝蛋白支架，以加强其机械强度，而通过再生技术得到的丝素蛋白微粒则常用于各种药物或细胞因子的给药[18，39]。因此，如能开发出一种丝素蛋白颗粒，既能加强支架的机械强度，又能达到给药的目的，将给组织修复工程带来很大的推进作用[18]。Saran等[43]用可塑性油灰和丝素蛋白颗粒负载羟基磷灰石、骨形态发生蛋白（BMP-2）等构成了BMP-2缓释系统，结果显示这样一个系统显著增加了大鼠C2C12的成骨分化。Fei等[44]将丝素蛋白和银纳米颗粒复合成颗粒材料，具有有效的抗菌和破坏细菌生物膜的能力。Bai等[45]报道采用干燥再溶解工艺并且控制反应的温度和浓度，可以有效地通过自组装工艺，生产具有不同纳米结构的丝素蛋白颗粒，为这一材料的应用带来新的启示。

3 蚕丝用于运动损伤修复的优劣

生物修补材料是自然产生或人工合成的一类材料，植入生物体后可通过机械支持，促进局部组织再生与修复。在考量生物修复材料的优劣时，首先应考虑材料的组织相容性，此外还需考量材料的机械强度、可降解性等[6，28]。蚕丝及其衍生材料作为生物修补材料的优劣如下。

就生物相容性而言，生丝的生物相容性并不理想。未脱胶或脱胶不完全的生丝用于人体时往往会引起以巨噬细胞增多为主要表现的炎症反应，这样的炎症反应会导致伤口愈合减缓，造成并发症增多等[46]。过去普遍认为蚕丝的丝胶会导致过敏反应[10]，而最近的研究则表明单独的丝胶或丝素并不会引起过敏反应[11，12]，只有二者结合在一起时才会引起过敏反应。因此要避免过敏反应只需单独应用其中一种组分即可。因此蚕丝用于组织工程前往往需要先经过脱胶处理，常用的方法是在碱性的热水中浸泡一定时间[47]。经妥善脱胶处理后的丝素蛋白在体内不呈现显著的免疫原性，其抗原性与胶原蛋白相同[13]。

近年来发现对丝素蛋白进行进一步工艺上的处理能够提高其促进局部组织再生的作用和生物相容性[18]。由此衍生出了多种再生丝素蛋白处理工艺，将蚕丝处理成水溶液后，经过各种技术，如喷涂[19]、湿纺[48]、静电纺丝[34]、冻干法[25]等，依据其生物效应的需要制成多种形态，如薄膜状[49]、多孔支架状[36]等，以达到不同的组织修复目的。将丝素蛋白制成薄膜状或多孔支架状能较好地增加材料的表面积，在材料本身生物相容性较好的情况下能够加强组织细胞在材料表面的附着，促进组织修复[18]。此外静电纺丝形成的多孔支架和冻干法形成的水凝胶具有与体内细胞外基质类似的微结构[28]，多项研究也证明在这样的支架上，干细胞能更好地分化为有功能的细胞，从而更好地与周围组织融合[30-33，42]。

生物力学强度也是蚕丝作为组织修复材料的重要原因之一。蚕丝本身即具有良好的机械强度，能承受的最大张力可达0.6 GPa[1]，因此蚕丝最初的应用即被用作缝线。然而近年来，蚕丝不再主要以单丝或纤维形式用于组织修复，各种再生丝素蛋白材料逐渐成为研究的热点[18]。由于骨和韧带依然是丝素蛋白组织工程的重要研究领域，因此已有多项研究通过在支架中加入多种填充物[39，40]，或者改变制作工艺[48]以提高支架的机械性能。目前丝素蛋白支架已有一定的力学强度，但尚未达到完全承载骨或者腱负载所需强度，要做到强度和生物特性俱佳还有待更多研究。

蚕丝在体内降解所需时间较长，蚕丝包埋于皮下后在1年内会失去其力学强度，2年内将无法在包埋处找到[6]，这一较长而又可预测的降解时间与骨及运动系统损伤愈合所需时间相匹配。因此将蚕丝用于运动系

统损伤的修复已经引起人们的关注[14]。蚕丝降解速度如此之慢主要是由于其中的二级和三级结构将酶切位点保护了起来[7]。然而目前常用的各种再生丝素蛋白材料的形成来自于丝素蛋白水溶液[18]，不具有蚕丝本身所具有的高度晶化的结构，因此有可能会影响到其在体内的降解速率，使其强度过早降低。再生丝素蛋白材料生产的工艺非常多，产出的材料由于结构不同在体内也有不同的降解速率，然而目前尚未见足够的文献说明各种不同的材料在体内的降解速率。降解速率过快可能会影响对应材料在愈合期较长的组织损伤中的应用。

4 展望

目前蚕丝已被用于组织工程修复的多个方面，其生物相容性问题已在多代人的努力下得到了较好的解决。而新工艺下产生的多孔修复材料由于其对细胞生长的支持作用较好，已成为目前研究的热点。然而生产出的多孔修复材料的生物力学强度是否足够适用于受力部位的组织修复成为研究中遇到的新问题。目前已有一些研究改良了支架的机械特性，但仍不能完全满足高负荷部位，如腱、骨以及关节等损伤的修复。如何提高这些材料的强度将是近期研究的一个方向。此外，多孔丝素蛋白材料的体内降解速率尚未得到很好的阐明，对这些方面的进一步研究将有助于更有效地将基础生物材料学的研究结果用于临床。

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2015.10.25

国家高技术研究发展计划（863计划）资助（编号：2015AA033703），国家自然科学基金项目资助（编号：81271958，81370052，81572108），高等学校博士学科点专项科研基金博导类资助课题（编号：20120071110067）

陈世益，Email：cshiyi@163.com