反复种植失败患者周围血树突状细胞数量和功能分析①

曾　勇　黄春宇　陈　现　梁佩燕　刁梁辉　陈　聪　张　谞　尹　彪

(深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心,中山生殖与遗传研究所，深圳518045)

反复种植失败患者周围血树突状细胞数量和功能分析①

曾勇②黄春宇②陈现②梁佩燕②刁梁辉②陈聪②张谞②尹彪②

(深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心,中山生殖与遗传研究所，深圳518045)

[摘要]目的：了解反复种植失败(Repeated implantation failure,RIF)患者周围血树突状细胞(Dendritic cells,DC)数量和功能的变化。方法：采集30例RIF患者及15例正常对照组的黄体中期周围血，采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对其DC细胞功能分子及亚群进行检测。 结果：与正常对照组相比，RIF患者的lin-HLA-DR+DC细胞占白细胞的比例无显著性变化(P>0.05)，DC细胞表面的共刺激分子(CD80和CD86)以及免疫耐受分子CD200也无显著性变化(P>0.05)。然而，RIF患者中CD11c+CD123-mDC细胞比例显著升高(P<0.05)，而CD11c-CD123+pDC细胞比例无显著性变化(P>0.05)。 结论：RIF患者的周围血mDC细胞比例显著升高，其可能是影响RIF患者妊娠结局的因素之一。

[关键词]母胎免疫耐受；反复种植失败；周围血；树突状细胞

据世界卫生组织(WHO)评估，目前生殖障碍的发生率约为15%。随着体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术的发展，生殖障碍得到了明显的改善。但是，在IVF 治疗过程中，排除高龄、生殖系统畸形、遗传、内分泌等异常因素后仍有10%~15%左右的患者经过多个周期治疗后仍然未能成功妊娠，通常这部分患者被定义为反复种植失败(Repeated implantation failure,RIF)[1]。研究证明，胚胎的种植与母体免疫环境息息相关，机体的免疫细胞参与调控胚胎的种植过程[1]。树突状细胞(Dendritic cell，DC)作为机体重要的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)，在正常妊娠中发挥重要作用。其中主要包括：(1) DC细胞通过低表达表面共刺激分子(CD80、CD86)[2]和高表达表面耐受分子(CD200)诱导母体对胎儿的免疫耐受[3]；(2)不同的DC细胞亚群，髓样DC细胞(myeloid DC,mDC)和浆细胞样DC细胞(plasmacytoid DC,pDC)，通过调节T细胞分化方向参与母胎免疫对话[4]；并且，有文献报道，在小鼠的种植窗期去除DC细胞，其着床位点的形成受到抑制，进而导致胚胎着床失败[5]。这些结果共同提示DC细胞的异常可能是影响RIF发生的重要因素。因此，本研究拟对RIF患者DC细胞的数量及其表面分子进行评估，进而为寻找新的母胎免疫致病因素，为寻找RIF患者治疗靶点提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象本研究选取2013年3月至2014年10月在本院生殖医学中心接受治疗的不孕不育患者为研究对象，年龄为23~35岁。所有患者均经过详细询问病史、染色体核型分析、全身及妇科检查以及内分泌等系统性检查。其中，正常对照组15人，RIF患者30人。

正常对照组的入选标准为：(1)男方因素(无精、少精、畸精)所致不孕而进行第一周期IVF的患者；(2)第一个移植周期成功妊娠；(3)夫妇双方染色体正常；(4)女方生殖解剖结构正常、内分泌正常、无自身免疫性疾病，月经规律；(5)使用常规促排卵方案，排卵日内膜厚度≥8 mm，双侧卵巢窦卵泡数均≥8个。

RIF患者的入选标准为：(1)符合RIF的定义：经历2次以上失败的移植周期且所移植总优质胚胎数≥6个；或经历3个以上取卵周期且每个周期均移植优质胚胎仍未取得临床妊娠；(2)夫妇双方染色体正常；(3)女方生殖解剖结构正常、内分泌正常、无自身免疫性疾病、无高凝倾向；(4)男方精液检查正常。

所有患者在同意并进入检查流程的第一个月经周期的黄体中期采集周围血，检测其中DC细胞比例、DC细胞亚群比例以及DC细胞表面分子的表达水平。本研究入选患者均签署了知情同意书，实验流程获得医院学术与伦理学委员会许可。

1.1.2实验设备和试剂FACS流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品，台式低速离心机为德国eppendorf公司产品。主要试剂包括流式抗体lin 1-FITC (CD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56-FITC)、HLA-DR-Percp、CD11c-APC、CD123-PE、CD80-PE、CD86-PE、CD200-PE，同型对照mouse IgG-PE以及FACS红细胞裂解液，均购于美国Becton Dickinson公司；新生牛血清为美国Hyclone公司产品。

1.2实验方法

1.2.1DC细胞比例的检测将100 μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加入到流式管中；然后加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp，振荡混匀，避光、室温孵育15 min；加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min,6 min进行细胞离心，去上清；加入含有5% 血清的PBS 2 ml充分混匀，1 300 r/min,6 min进行细胞离心，去上清；加入200 μl PBS进行细胞重悬；利用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(BD，美国)进行检测并用并用FlowJo软件进行结果分析。

1.2.2DC细胞表面CD80和CD86表达水平的检测将100 μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血分别加入三支流式管中；其中管1中加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、20 μl mouse IgG-PE，作为阴性对照组；管2中加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、20 μl CD80-PE，管3中加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、20 μl CD86-PE，作为实验组，振荡混匀，避光、室温孵育15 min；加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min,6 min进行细胞离心，去上清；加入含有5% 血清的PBS 2 ml充分混匀，1 300 r/min,6 min进行细胞离心，去上清；加入200 μl PBS进行细胞重悬；利用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(BD，美国)进行检测并用FlowJo软件进行结果分析。

1.2.3DC细胞表面CD200表达水平的检测其实验步骤及检测方法与实验方法1.2.2相同，其中同型对照为mouse IgG-PE，实验组检测抗体为CD200-PE。

1.2.4DC细胞亚群比例的检测将100 μl乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加入到流式管中；然后加入10 μl lin 1-FITC、10 μl HLA-DR-Percp、5 μl CD123-PE、5 μl CD11c-APC，振荡混匀，避光、室温孵育15 min；加入红细胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min,6 min进行细胞离心，去上清；加入含有5% 血清的PBS 2 ml充分混匀，1 300 r/min,6 min进行细胞离心，去上清；加入200 μl PBS进行细胞重悬；利用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(BD，美国)进行检测和FlowJo软件进行结果分析。

2结果

2.1RIF患者DC细胞数量分析图1A为两色标记检测树突状细胞比例的示意图。lin-HLA-DR+的细胞即为DC细胞。图1B显示，与正常对照组相比，RIF患者的lin-HLA-DR+DC细胞占白细胞比例无显著性差异[(1.03±0.25)% vs (0.96 ±0.36)%，P> 0.05]。

2.2FCM 检测RIF患者DC细胞表面共刺激分子表达水平分析RIF患者中DC细胞的抗原提呈能力是否发生变化，FCM检测结果显示，与正常对照组相比，RIF患者中DC细胞表面共刺激分子CD80[(4.15±3.36)% vs (4.07±3.84)%，P>0.05，图2A、B]和CD86[(63.33±9.02)% vs (56.84±8.36)%，P>0.05，图2C、D]的表达水平均无显著性差异。

2.3FCM 检测RIF患者DC细胞表面CD200表达水平进一步分析RIF患者中DC细胞的免疫耐受功能是否发生改变，本实验采用流式细胞术对介导DC细胞免疫耐受功能的CD200分子进行检测(图3A)。FCM结果显示，与正常对照组相比，RIF患者DC细胞表面CD200的表达水平[(33.66±11.98)% vs (37.85±14.01) %]有下降趋势，但是并无显著性差异(P>0.05,图3B)。

2.4FCM 检测RIF患者DC细胞亚群比例图4A为四色标记检测树突状细胞亚群比例的示意图。

lin-HLA-DR+的细胞即为DC细胞，其中，CD11c+CD123-的细胞为mDC，CD11c-CD123+的细胞为pDC。FCM结果显示，RIF患者CD11c+CD123-mDC细胞比例显著高于正常对照组[(49.83±8.94) % vs (43.71±7.43) %，P<0.05，图4B]；而CD11c-CD123+pDC细胞比例在两组之间无显著性差异[(33.82±12.29) % vs (31.53±9.16) %，P>0.05,图4C)]。

3讨论

胚胎植入是生殖过程的重要环节，是影响妊娠结局的关键步骤。胚胎植入是胚胎与母体相互识别、相互融合的复杂过程，受多种因素调控，而其中母体免疫状态的稳定尤为重要。对于母体来说，胚胎是一种异体移植物，其能够被母体正确识别而不受到排斥，此过程中母体的免疫耐受环境是必不可少的[6]。一旦机体免疫细胞数量或者功能失衡，免疫耐受环境受到破坏，母体可能会对胚胎产生排斥，进而导致种植失败[7]。研究表明，DC细胞是免疫机制的重要调节成分，并且在免疫耐受和免疫源性耐受中发挥重要作用[8,9]。此外，Plaks等[5]报道，在小鼠的种植窗期去除DC细胞，其着床位点的形成受到抑制，导致胚胎着床失败。由此推测，DC细胞介导免疫耐受的功能在胚胎种植过程中发挥重要作用。然而，DC细胞在RIF患者中的数量和功能状态还未见报道。

DC细胞是一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功能都不同的白细胞，它们可以与T细胞、B细胞相互作用，以刺激和控制适当的免疫反应。DC细胞数量与多种免疫性紊乱疾病相关，其中包括恶性肿瘤和慢性病毒感染等[10，11]。本研究结果显示，RIF患者中DC细胞比例并无显著性变化，由此提示，DC细胞数量可能并不是胚胎种植失败的关键因素。然而，文献报道，除了DC细胞数量之外，介导DC细胞免疫耐受的表面分子在妊娠中也发挥了必不可少的作用。CD80和CD86是DC细胞的共刺激分子，其与MHC类分子协同向T细胞传递抗原信号，进而启动T细胞免疫反应[12]。研究证明，正常妊娠中，母体DC细胞表面的共刺激分子CD80和CD86表达下调，降低其对胚胎的抗原提呈作用，抑制T细胞对胚胎的免疫排斥反应，进而形成母体对同种异体胚胎的免疫耐受[2]。然而，RIF患者周围血中DC细胞的抗原提呈能力还未见报道。因此，本研究对RIF患者DC细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达水平进行了检测。实验结果显示CD80和CD86的表达水平在RIF患者与正常对照组之间并无显著性差异。由此推测，RIF患者中DC细胞的共刺激分子表达正常，其可能并不是影响RIF患者妊娠结局的因素。

CD200是与免疫细胞共刺激分子相关的表面蛋白。作为共刺激分子(CD80和CD86)的对立分子，其是免疫耐受信号通路中的重要角色[13]。研究证明，DC细胞表面的CD200通过与其受体CD200R相互结合，促进吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO) 的表达，进而抑制活性T细胞的增殖，并诱导T细胞向调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)方向分化，介导免疫耐受的形成[3]。因此，本研究对RIF患者DC细胞表面CD200的表达水平进行了检测。实验结果显示RIF患者与正常对照组相比，CD200的表达水平有下降的趋势，但是不具有显著性差异。此阴性结果有可能是由于样本量较小造成的，所以，后续还需进一步扩大样本量对此结果进行确证。

研究证明，DC不仅可以通过调控表面共刺激分子和免疫耐受分子的表达进而参与妊娠过程，还具有发挥不同免疫调节功能的细胞亚群。根据细胞表面分子的表达情况，DC细胞可以分为mDC和pDC两大类。其中，mDC表达CD11c，并且分泌白介素-12 (Interlukin-12,IL-12)等细胞因子，诱导辅助性T (T helper,Th)细胞向Th1分化[14]；而pDC表达CD123，分泌Ⅰ型干扰素(InterferonⅠ,IFN Ⅰ) 和IL-10等细胞因子，诱导Th细胞向Th2分化[15,16]。大量研究表明，正常妊娠中，机体的免疫状态偏向于“Th2型”反应[17-19]。当机体的mDC升高或pDC数量降低时，机体免疫环境可能偏向于“Th1型”反应，进而引起先兆子痫等不良妊娠结局的发生[20]。因此，本研究进一步对RIF患者周围血中DC细胞亚群比例进行了检测，实验结果表明RIF患者中mDC占DC细胞的比例显著高于正常对照组，而pDC细胞亚群比例在两组之间无显著差异。前期研究报道妊娠期间低水平的mDC数量在维持母体对胚胎的免疫耐受中发挥重要作用[4]。以上结果共同提示，RIF患者确实存在DC细胞亚群失衡的状况，而且mDC比例的升高可能是影响RIF患者不良妊娠结局的因素之一。

但是，本研究结果并未阐明DC细胞数量变化与妊娠结局之间的相关性，及其影响妊娠结局的具体机制。所以，本实验室拟继续进行以下研究：(1)分析RIF患者周围血mDC细胞数量与Th1型细胞数量的相关性，及其与RIF患者下一个移植周期妊娠结局的相关性，从而观察周围血mDC是否通过调节母体促炎状态进而影响妊娠结局；(2)利用免疫组化技术对RIF患者黄体中期子宫内膜中DC细胞数量进行检测，并与对照组进行比较；分离纯化两组人群的子宫内膜DC细胞，并分别与滋养层细胞系进行共培养，分析并比较其对滋养层细胞增殖、凋亡和侵袭等的影响。

综上所述，RIF患者中周围血DC细胞数量及其表面调节分子水平无显著性变化，而mDC数量显著高于正常可孕妇女，其异常可能导致了RIF患者不良妊娠结局的发生，但是具体机制还有待进一步深入研究。

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[收稿2015-04-22修回2015-06-24]

(编辑张晓舟)

Analysis of quantity and function of dendritic cells in peripheral blood of patients with repeated implantation failure

ZENGYong,HUANGChun-Yu,CHENXian,LIANGPei-Yan,DIAOLiang-Hui,CHENCong,ZHANGXu,YINBiao.FertilityCenterofShenzhenZhongshanUrologyHospital,ShenzhenZhongshanInstituteforReproductiveMedicineandGenetics,Shenzhen518045,China

[Abstract]Objective:To evaluate the quantity and function changes of dendritic cells (DC) in peripheral blood of patients with repeated implantation failure (RIF).Methods: 30 patients with RIF and 15 normal controls were enrolled in this study,and the peripheral blood was collected during the mid-luteal phase.The percentage of DC subsets and the expression levels of functional molecules were assessed by flow cytometric analysis.Results: Compared with normal controls,the percentage of lin-HLA-DR+DC cells accounting for leukocytes in patients with RIF was not significantly different (P>0.05).There were also no significant differences in the expression levels of co-stimulatory molecules (CD80 and CD86) and immune tolerant molecules CD200 on DC cells surfaces between patients with RIF and normal controls (all P>0.05).In addition,the percentage of CD11c+CD123-mDC accounting for DC cells was significantly increased in patients with RIF (P<0.05),however,the percentage of CD11c-CD123+pDC was similar (P>0.05).Conclusion: The percentage of mDC accounting for DC cells was significantly increased in patients with RIF,which may be one of factors affecting pregnancy outcomes.

[Key words]Maternal-fetal immune tolerance；Repeated implantation failure；Peripheral blood；Dendritic cells

通讯作者及指导教师：尹彪(1981年-)，男，助理研究员，主要从事生殖临床免疫与遗传学研究，E-mail:yinbiao2004@hotmail.com。

作者简介：曾勇(1966年-)，男，副主任医师，主要从事生殖临床及免疫研究,E-mail:zengyong1966@gmail.com。

中图分类号R318.16
①本文为深圳市基础研究项目(JCYJ20120829150019348)。
②同时供职于深圳中山生殖与遗传研究所，深圳518045。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0239-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.021