HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达与意义①

钟裕恒　黄　湘　陈敬林　谭家余　米贤军　刘祥玉

(南方医科大学第三临床医学院　南方医科大学附属中山博爱医院，中山528403)

HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达与意义①

钟裕恒黄湘②陈敬林②谭家余③米贤军④刘祥玉④

(南方医科大学第三临床医学院南方医科大学附属中山博爱医院，中山528403)

①本文为本文为广东省医学科研基金项目(A2013875)及国家自然科学基金 (81101534) 资助。

②南方医科大学附属中山博爱医院产前诊断中心，中山528403。

③南方医科大学附属中山博爱医院中心ICU,中山528403。

④南方医科大学附属中山博爱医院病理科,中山528403。

[摘要]目的：检测HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达。方法：收集76例宫颈癌、105例CIN及28例正常宫颈标本，采用免疫组织化学的方法检测HSPC238的表达，比较不同组织中HSPC238表达的差异。结果：正常组织和癌组织中的HSPC238的表达强度无显著差异(Z=-0.242，P>0.05)宫颈上皮内瘤变组织(CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ)与正常组织有显著差异(χ2=19.159，P<0.01)，并且发现HSPC238的表达与CIN的分级存在显著相关性，随着CIN级别升高，染色程度降低(rs=-0.327，P<0.01 )。结论：HSPC238的低表达与宫颈肿瘤的发生发展可能有一定关系。

[关键词]HSPC238;宫颈癌；宫颈上皮内瘤变，免疫组化

HSPC238是由人类基因LOC51255编码的，含153个氨基酸的C3HC4型锌指蛋白(hypothetical protein LOC51255，HSPC238，RN181，NP_057578)。迄今为止，HSPC238的功能知之甚少。Brophy等人在2008年首次发现，它具有E3泛素蛋白连接酶活性[1]。在我们的前期研究中发现，不论在体内还是体外，HSPC238均可以抑制肝癌细胞的生长[2]。

肝癌的发展大部分经历肝炎→肝硬化→肝癌的三步曲，而宫颈癌患者的发病过程也是从宫颈炎→宫颈上皮内瘤变→宫颈癌的过程；此外，HBV为肝癌发生演变的主要病因之一[3]，而HPV也被认为是宫颈上皮内瘤变恶性转化的必要因素之一[4]。肝癌与宫颈癌进展演变的这些相似性使我们很好奇具有抑制肝癌细胞生长作用的HSPC238是否对宫颈癌的发生发展有同样的影响。为了初步探讨HSPC238与宫颈癌发病的相关性，我们采用免疫组织化学技术了解HSPC238在宫颈上皮内瘤变组织和宫颈癌组织中的表达情况，从而为进一步研究HSPC238在宫颈癌进展中的功能奠定基础。

1材料与方法

1.1病例与标本选取2012年1月~2013年1月中山市博爱医院病理科保存的病理组织蜡块，按照《妇产科学》第七版诊断标准，由南方医科大学病理学专家以双盲阅片法进行病例确诊的宫颈癌标本76例(32~67岁)、宫颈上皮内瘤变105例(CINⅠ50例,CINⅡ30例,CINⅢ25例，年龄23~67岁)作为研究对象。所有标本均经常规石蜡包埋，连续切片(厚4 μm)。患者术前均未接受过放射性治疗、化学治疗或免疫治疗等治疗。

1.2试剂与实验方法宫颈组织标本行免疫组织化学染色(ABC法)。常规试剂购自上海罗氏公司，包括：二甲苯、梯度酒精、PBS缓冲液、中性树胶、双氧水、显色试剂盒、苏木素复染剂、二抗及染色试剂盒等。一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，工作浓度为1∶150。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡，以枸橼酸盐进行抗原修复，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，最后在光学显微镜下观察染色。以PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性表达HSPC238的肝组织做阳性对照。

1.3结果判定采用半定量方法，细胞中见到棕黄色颗粒分布为阳性。根据染色程度进行判断：0为基本不着色，+为淡着色，++为着色适中，+++为深着色。

1.4统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行分析。两独立样本的比较采用Mann-Whitney U检验，多个独立样本的比较采用Kruskal-Wallis检验，相关性统计采用Spearman等级相关分析，设定P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

经统计，发现正常组织和宫颈癌组织的染色程度没有显著差异(Z=-0.242,P>0.05)，见表1、图1C、D；正常组织和CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ的染色程度有显著差异，(χ2=19.159,P<0.01)；并且发现HSPC238的染色程度与CIN的分级存在显著相关性，随着CIN级别升高，染色程度降低(rs=-0.327,P<0.01 )见表2、图2A~C。

表1正常组织和宫颈癌中HSPC238的表达

Tab.1Expression of HSPC238 in normal cervical epithelial and cervical cancer

Note：Z=-0.242，P>0.05.

表2不同级别CIN中HSPC238的表达

Tab.2Expression of HSPC238 in defferent grades of cervical intraepithelial neoplasia

Note：rs=-0.327,P<0.01，χ2=19.159,P<0.01.

3讨论

宫颈癌是威胁女性健康和导致死亡的主要恶性肿瘤之一。Shi等[4]在2012年中国宫颈癌的负担中估算我国宫颈癌新发病例数可能会从2010年的27 000~130 000例/年，将会逐渐增多到2050年的42 000~187 000例/年。阐明其发生发展的机理是防控和治疗宫颈癌的重要环节。

HSPC238是新发现的C3HC4型锌指蛋白。研究表明锌指蛋白是一类重要的转录调控因子，锌指蛋白的异常与许多人类疾病及癌症包括宫颈癌的发生有关,如锌指蛋白ZNF384，ZEB1,RNF152[5-7]。近些年人工锌指蛋白的生物学应用受到重视[8]，具有渗透性的人工锌指蛋白AZPs能作为潜在的蛋白抗病毒药[9]。越来越多的研究将锌指蛋白作为癌症治疗的干预靶点。因此探索HSPC238与宫颈癌演变的相关性，对于揭示宫颈癌的发生机制和指导治疗是具有潜在价值的。

HPV感染是宫颈癌发生发展的必要条件。E6为HPV基因组3个功能区中的一个亚区，E6含有结构为Cys-x-x-Cys的锌指结构[10]，它可通过P53途径使癌细胞绕过G1/S和G2/M检查点，是细胞永生化及恶性转化的关键因素[11]，在宫颈癌的演变过程中发挥重要作用。研究发现，E6相关蛋白(E6-AP)具有泛素连接酶作用[12]，可代替MDM2促进P53的泛素化降解，解除P53对细胞周期蛋白的抑制作用，使细胞绕过关键周期检查点转为恶性增殖模式。

新近研究提示，与多种肿瘤发生密切相关的核糖体蛋白RPS27a可以与MDM2中心的酸性区域结合，干扰MDM2的泛素连接酶E3的功能。在应激过程中，过表达RPS27a可明显抑制MDM2介导的P53的泛素化降解过程，使P53分解减少进而引起细胞周期阻滞[13]。有趣的是，在我们的前期研究中通过酵母双杂交，激光共聚焦，免疫共沉淀和免疫印迹实验发现，在肝癌细胞中HSPC238可以与RPS27a结合并且低表达HSPC238可以下调RPS27a(此部分论文正在投稿中)。由于肝癌和宫颈癌的发病过程具有相似性，由此，课题组推测在宫颈癌中HSPC238也可以调节RPS27a。

本次研究发现HSPC238的染色程度与CIN的分级存在显著相关性，随着CIN分级的升高，HSPC238的表达率降低，说明HSPC238的低表达可能有利于宫颈肿瘤的进展。但在宫颈癌患者中，该蛋白的表达率并没有显著降低，这种现象可能是由于细胞耐受造成的,提示HSPC238在宫颈癌前病变和宫颈浸润癌中可能起着不一样的作用。关于CIN进展为宫颈癌的机理仍是研究的难点。为此，我们试图从新的角度研究宫颈癌的发病机理，揭示HSPC238与宫颈癌的关系。

尽管本课题仅对HSPC238在宫颈肿瘤组织中的表达情况进行了初步研究，尚不足以揭示HSPC238在宫颈肿瘤发生中所起的作用，但结合课题组的前期研究(部分研究结果正在撰写投稿中)，我们推测HSPC238可能通过以下机制(如图3)参与宫颈肿瘤的发生发展。即在宫颈上皮内瘤变患者中，HSPC238表达下降，使RPS27a 下调，于是对MDM2泛素化降解p53的干扰作用减少，具有抑癌作用的p53水平下调，从而促进宫颈癌的发生。但HSPC238是否在宫颈肿瘤中起着一种独特的作用，是否能通过RPS27a影响E6-AP参与的MDM2-P53通路进而影响宫颈肿瘤的生长，需要后续实验来进一步验证。我们希望此研究能够为揭示宫颈癌的发病机制提供一条新线索。

参考文献：

[1]Brophy TM,Raab M,Daxecker H,etal.RN181,a novel ubiquitin E3 ligase that interacts with the KVGFFKR motif of platelet integrin alpha(IIb)beta3[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,369(4):1088-1093.

[2]Wang S,Huang X,Li Y,etal.RN181 suppresses hepatocellular carcinoma growth by inhibition of the ERK/MAPK pathway[J].Hepatology,2011,53(6):1932-1942.

[3]Block TM,Mehta AS,Fimmel CA,etal.Molecular viral oncology of hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2003,22(33):5093-5107.

[4]Shi JF,Canfell K,Lew JB,etal.The burden of cervical cancer in China:synthesis of the evidence[J].Int J Cancer,2012,130(3):641-652.

[5]Mori S,Takeuchi T,Ishii Y,etal.Identification of APOBEC3B promoter elements responsible for activation by human papillomavirus type 16 E6[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,460(3):555-560.

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[10]Yuqi Liu1,James D.Baleja1.Structure and function of the papillomavirus E6 protein and its interacting proteins.Frontiers in Bioscience [J]. 2008;(13):121-134.

[11]Münger K,Baldwin A,Edwards KM,etal.Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis[J].J Virol,2004,78(21):11451-11460.

[12]Camus S,Higgins M,Lane DP,etal.Differences in the ubiquitination of p53 by Mdm2 and the HPV protein E6[J].FEBS Lett,2003,536(1/3):220-224.

[13]Sun XX,Devine T,Challagundla KB,etal.Interplay between ribosomal protein S27a and MDM2 protein in p53 activation in response to ribosomal stress[J].J Biol Chem,2011,286(26):22730-22741.

[收稿2015-05-26修回2015-07-21]

(编辑许四平)

Expression and significance of HSPC238 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer

ZHONGYu-Heng,HUANGXiang,CHENJing-Lin,TANJia-Yu,MIXian-Jun,LIUXiang-Yu.ThirdClinicalCollegeofSouthernMedicalUniversity,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Zhongshan528403,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of HSPC238 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.Methods: We collected 76 cases of cervical cancer,105 cases of CIN and 28 cases of normal cervical epithelial.Then we investigated the expression of HSPC238 by using immunohistochemistry and compared the significant differences between them.Results: There was no significant difference in the expression of HSPC238 between the cervical cancer and normal cervical epithelial(Z=-0.242，P>0.05).However,there was significant difference between the cervical intraepithelial neoplasia and normal cervical epithelial(χ2=19.159，P<0.01)and the expression of HSPC238 was correlated with the grades of CIN.The expression of HSPC238 decreased when the grade of CIN was increasing.(rs=-0.327，P<0.01 ).Conclusion: The low expression of HSPC238 might be correlated with the development of cervical neoplasia.

[Key words]HSPC238；Cervical cancer;Cervical intraepithelial neoplasia;Immunohistochemistry

通讯作者及指导教师：黄湘(1971年- )，女，博士，主任技师，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫及产前诊断研究，E-mail:340382761@qq.com。

作者简介：钟裕恒(1991年-)，女，在读硕士，主要从事肿瘤免疫研究,E-mail:1119282101@qq.com。

中图分类号R737.33

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0223-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.017 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.018