Rab5a促进CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达①

陈俊娜　孙晓琳　董仕超　邹　凯　刘　欢　王　岩　王　雪　刘　芳　谢基明　王玉珍

(内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特010018)

Rab5a促进CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达①

陈俊娜孙晓琳董仕超邹凯刘欢王岩王雪刘芳谢基明②王玉珍

(内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特010018)

[摘要]目的：采用稳定表达Rab5a及其显性负性突变体Rab5aN133I的巨噬细胞系RAW264.7，研究Rab5a及其突变体过表达后对CpG诱导的炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达的影响。方法：通过脂质体法将Rab5a及其突变体Rab5aN133I的真核表达载体转染到RAW264.7细胞中，用G418选择性培养基进行筛选，建立稳定表达Rab5a、Rab5aN133I的细胞系。通过RT-PCR、Real time-PCR和Western blot方法鉴定稳定表达的细胞系。用CpG刺激稳定表达Rab5a、Rab5aN133I的细胞系8 h后检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的表达量变化。结果：RAW264.7转染Rab5a真核表达载体后Rab5a的表达量显著高于对照质粒转染细胞(P<0.05)。Rab5a过表达后，在CpG刺激作用下RAW264.7分泌的TNF-α、IL-1β显著升高(P<0.01)，IFN-β的分泌也显著升高(P<0.05)，而Rab5aN133I过表达后上述细胞因子的分泌均有所恢复。结论：Rab5a促进了CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达，Rab5a可能是TLR9信号通路的正向调控蛋白。

[关键词]Rab5a;CpG;TLR9;TNF-α;IL-1β;IFN-β

Rab5a存在于质膜、早期内体和网格蛋白覆盖的囊泡上，作用是调控胞吞过程中胞吞泡和早期内体的融合以及囊泡的再循环。Rab5a在发挥功能时不断地进行着GTP/GDP的循环[1]，富集并激活胞内多种效应分子，调控各早期内体之间以及胞吞泡和早期内体之间的融合。大量的研究证实，若Rab5a蛋白突变，可以引起细胞形态和功能发生异常，提示改变Rab5a蛋白的结构和功能，则可能导致某些疾病的发生。

Toll样受体(TLR)作为模式识别受体家族中最重要的一员，在启动天然免疫应答和促进适应性免疫应答的过程中起着至关重要的作用[2]。TLR9是Ⅰ型跨膜蛋白受体，它可以直接识别微生物的含有未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)序列的DNA[3]。人工合成的含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)可以模拟原核生物的DNA，激活机体的免疫系统，通过信号传导从而促进细胞因子的合成与释放，促进或抑制炎症反应，从而调节免疫应答[4]。

本实验在建立稳定表达Rab5a以及Rab5a显性负突变Rab5aN133I的RAW264.7细胞系的基础上，研究Rab5a对CPG诱导的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β表达的影响，并探讨Rab5a发挥作用的功能位点。本研究有利于深入理解天然免疫应答的调控机制，为探索感染性疾病治疗的靶标提供科学的依据。

1材料与方法

1.1细胞系与试剂RAW264.7细胞株(北京协和细胞库)，DMEM培养基、胰蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(兰州民海生物试剂有限公司)，转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)，反转录酶、Trizol(TaKaRa)，DEPC(天根生物科技有限公司)，含有CpG基序的寡核苷酸CpG ODN(5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3′) 全链硫代修饰(上海生工)，Real time mix(北京康为世纪)，BCA蛋白检测试剂盒(PIERCE公司)，抗体anti-Rab5a、anti-β actin(Santa Cruz公司)。

1.2实验方法

1.2.1小鼠巨噬细胞株RAW264.7的培养RAW264.7细胞株解冻后接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，1~2 d换液或传代一次。

1.2.2细胞筛选RAW264.7 细胞(4×105)接种于6孔板中，DMEM培养基37℃过夜培养。将1 μg的真核表达质粒：空质粒(pcDNA3.1)、Rab5a过表达质粒(pcDNA3.1/mRab5a)、Rab5a N133I显性负突变质粒(pcDNA3.1/tRab5a)与Lipofectamine 2000试剂温和混匀后室温放置20 min，以便形成质粒-脂质体复合物，然后将复合物加入到待转染细胞中，转染8 h后换液。48 h后加入G418(800 μg/ml)作用3周，筛选稳定表达的细胞株。

1.2.3细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β表达量的测定采用RT-PCR和Real time-PCR检测Rab5a过表达及失活突变后对CpG刺激的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β的影响。实验中使用的引物序列见表1。

表1本实验中使用的引物序列

Tab.1Primers used in experiment

Note：1 is the specific primers,2 are the Real time fluorescence quantitative PCR primers.

1.3统计学分析应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan法进行多重比较分析，P<0.05时认为具有显著性差异。

2结果

2.1CpG促进RAW264.7细胞中Rab5a mRNA的表达有研究发现Rab5主要定位在早期胞内体中，首先我们检测了巨噬细胞中Rab5a是否受到TLR9活化的影响，用0.3 μmol/L的CpG刺激RAW264.7细胞0、2、4、8、12、24 h后RT-PCR研究Rab5a mRNA的表达水平。如图1所示，CpG刺激后，Rab5a的mRNA表达水平在2 h和4 h时有所升高，随后降低并恢复至正常水平。接着我们利用Real time-PCR进行了定量分析，如图2所示，CpG刺激2 h和4 h后Rab5a的表达水平显著升高，而12 h时Rab5a的表达水平又恢复到正常水平。这种转录水平的动态变化提示，Rab5a的表达受到TLR9配体CpG的调控。

2.2Rab5a稳定表达的细胞株的鉴定如图3A的RT-PCR结果所示，pcDNA3.1/mRab5a、pcDNA3.1/tRab5a的mRNA水平与转染对照质粒pcDNA3.1的细胞相比，高出约2倍左右。该结果说明我们已经得到了表达上述三种质粒的细胞株。为了进一步验证实验结果的准确性，我们随后利用Real time-PCR和Western blot的方法进行进一步的验证。如图3B和3C，所得结果与RT-PCR结果相似。根据RT-PCR、Real time-PCR和Western blot的结果来看，我们已经得到了稳定表达mRab5a及其突变体的细胞株。

2.3Rab5a促进CpG诱导的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IFN-β的表达从前期的实验结果我们可以得出，用TLR9的配体CpG活化巨噬细胞后，

mRab5a的表达水平有所升高，提示Rab5a可能参与了TLR9的信号转导过程。为了阐明Rab5a在CpG诱导的TLR9的信号转导通路中的作用，我们首先检测了Rab5a对CpG刺激巨噬细胞后分泌细胞因子的影响。TNF-α、IL-1β的分泌主要是受MyD88依赖途径的调控，如图4和图5所示，Rab5a过表达后，显著地促进了CpG诱导的RAW264.7细胞中TNF-α和IL-1β的分泌。相反的，失活突变的Rab5a则可以抑制TNF-α、IL-1β的分泌。IFN-β的分泌受转录因子IRF7的调控，如图6所示，Rab5a过表达后也显著地促进了IFN-β的表达，而失活突变的Rab5a则失去了这种促进功能。

3讨论

Rab蛋白参与了细胞内的蛋白转运过程，包括囊泡的形成、迁移和融合[5,6]。但是，越来越多的证据显示出Rab成员具有其他的生物学功能。如定位于晚期内体的GTP酶Rab7，它可以通过调控胞内营养物质的内陷和降解，从而参与到生长因子调节的细胞凋亡过程中[7]；与甲状腺相关的腺癌中，Rab5a和Rab7的表达均有所增加[8]；在宫颈鳞癌(Cervical squamous cell carcinomas，CSCC) 组织中，Rab5a在EGFR介导的信号传导通路中发挥正性调节作用，而Rab21则在EGFR介导的信号传导通路中发挥负性调节作用[9]；Rab25与乳腺癌的发病密切相关；Rab39a与caspase-1结合后促进了经由caspase-1介导的IL-1β的分泌[10]。这些证据证明了Rab家族能够参与囊泡转运之外的多种生物进程，但是Rab家族的成员是否或如何参与调节天然免疫中TLR9信号转导还有待探索。巨噬细胞是固有免疫应答中最重要的细胞亚群，是广泛地存在于人体中的具有强大吞噬能力的一类细胞。除吞噬功能外，巨噬细胞中存在的模式识别受体被活化后，能诱导巨噬细胞产生大量的Ⅰ型干扰素和促炎性因子。本实验中我们研究了Rab5a对TLR9信号通路的调控作用。TLR9被相应的配体CpG激活后，通过MyD88依赖的胞内信号转导途径传递信号。MyD88依赖途径活化产生IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α等细胞因子，同样依赖于MyD88的IRF7也可以诱导Ⅰ型干扰素如IFN-β的产生[11]。我们的实验结果表明，Rab5a过表达后，促进了CpG诱导的促炎性因子TNF-α、IL-1β和Ⅰ型干扰素IFN-β细胞因子的产生，而失活突变的Rab5aN133I阻断了这种效应。由于TLR信号转导的主要输出结果是细胞因子，我们的研究表明Rab5a可以促进CpG诱导的TLR9信号。

综上所述，Rab5a正向调控巨噬细胞中CpG诱导的炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达，Rab5a可能是一个新的正向调控TLR9信号通路的蛋白。

参考文献：

[1]Hoffenberg S,Liu X,Nikolova L,etal.A novel membrane-anchored Rab5 interacting protein required for homotypic endosome fusion[J].J Biol Chem,2000,275(32):24661-24669.

[2]Iwasaki A,Medzhitov R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system[J].Science,2010,327(5963):291-295.

[3]Arunkumar N,Liu C,Hang H,etal.Toll-like receptor agonists induce apoptosis in mouse B-cell lymphoma cells by altering NF-κB activation[J].Cell Mol Immunol,2013,10(4):360-372.

[4]He H,Genovese KJ,Swaggerty CL,etal.Differential induction of nitric oxide,degranulation,and oxidative burst activities in response to microbial agonist stimulations in monocytes and heterophils from young commercial turkeys[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,123(3/4):177-185.

[5]Seachrist JL,Ferguson SS.Regulation of G protein-coupled receptor endocytosis and trafficking by Rab GTPases[J].Life Sci,2003,74(2/3):225-235.

[6]Markgraf DF,Peplowska K,Ungermann C.Rab cascades and tethering factors in the endomembrane system[J].FEBS Lett,2007,581(11):2125-2130.

[7]Snider MD.A role for rab7 GTPase in growth factor-regulated cell nutrition and apoptosis[J].Mol Cell,2003,12(4):796-797.

[8]Cheng KW,Lahad JP,Gray JW,etal.Emerging role of RAB GTPases in cancer and human disease[J].Cancer Res,2005,65(7):2516-2519.

[9]耿晓涛,马栋辉,古丽娜·库尔班,等.宫颈鳞癌EGFR、Rab5a、Rab21蛋白表达与其临床特征及近期疗效的相关性研究[J].新疆医科大学学报,2015,38(3):344-349.

[10]Becker CE,Creagh EM,O′neill LA.Rab39a binds caspase-1 and is required for caspase-1-dependent interleukin-1beta secretion[J].J Biol Chem,2009,284(50):34531-34537.

[11]Ma C,Spies NP,Gong T,etal.Involvement of DNA-PKcs in the type I IFN response to CpG-ODNs in conventional dendritic cells in TLR9-dependent or-independent manners[J].PLoS One,2015,10(3):e0121371.

[收稿2015-04-25修回2015-06-16]

(编辑张晓舟)

Rab5a promotes expression of pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN in CpG induced macrophages

CHENJun-Na,SUNXiao-Lin，DONGShi-Chao,ZOUKai,LIUHuan,WANGYan,WANGXue,LIUFang,XIEJi-Ming,WANGYu-Zhen.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,China

[Abstract]Objective:Using the macrophage cell lines RAW264.7 stably expressing Rab5a and its dominant negative mutant Rab5aN133I as models to analyze the effect and the mechanism of Rab5a,Rab5aN133I on CpG-induced production of pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN.Methods: The eukaryotic expression vectors of Rab5a and Rab5aN133I were transfected into RAW264.7 cells by liposome,and screened with G418.The G418-resistant colonies were obtained and amplified.The transformed cell lines were identified by RT-PCR,Real time-PCR and Western blot.The production of cytokines were measured after transformed cell lines of Rab5a and Rab5aN133I was stimulation with CpG for 8 h.Results: Rab5a expression in transfected cells was significantly higher than the control cell group (P<0.05).Overexpression of Rab5a significantly promoted the production of TNF-α，IL-1β (P<0.01) and IFN-β (P<0.05) in CpG stimulated RAW264.7.The production of cytokines was restored in Rab5aN133I transfected cell line.Conclusion: Rab5a promotes CpG-induced pro-inflammatory cytokines and type Ⅰ IFN in macrophages,it may be act as a positive regulator in TLR9 signaling pathway.

[Key words]Rab5a；CpG；TLR9；TNF-α；IL-1β；IFN-β

通讯作者及指导教师：王玉珍(1976年-)，女，教授，硕士生导师，主要从事分子免疫学方面的研究，E-mail:wangyuzhen817@126.com。

作者简介：陈俊娜(1988年-)，女，在读硕士，主要从事分子免疫学的研究。

中图分类号R392.1
①本文为国家自然科学基金项目(No.31270922,81360397,81560677)。
②内蒙古自治区人民医院检验科，呼和浩特010020。

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)02-0165-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.004 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.005