全基因组测序在细菌耐药性分析中的应用

李 秀，强 斌，徐正中，孟 闯，陈 祥，焦新安



全基因组测序在细菌耐药性分析中的应用

李 秀，强 斌，徐正中，孟 闯，陈 祥，焦新安

细菌耐药性特别是多重耐药性已经成为全球共同关注的问题，其严重威胁疾病的治疗，并造成巨大的经济损失。传统的耐药性分析方法耗时耗力，全基因组测序作为一种新型技术，可能会成为一种简单、快速和高效的耐药性分析方法，且具有较好的敏感性和特异性。除了在已知耐药基因型确定和耐药表型预测外，该方法还可发现新的潜在的耐药基因。现对全基因组测序在细菌耐药性中的应用作一综述。

耐药性；全基因组测序；耐药基因

细菌的耐药性问题在抗菌药物应用初期就受到关注。20世纪40年代青霉素开始应用于临床，几乎在同一时期就发现青霉素酶的存在，细菌的耐药性问题开始出现[1]。抗菌药物仅仅使用70多年，很多曾经可以轻易治疗的细菌感染疾病现在已经很难治疗。当前，全球细菌耐药性问题仍以惊人的速度在加剧，但几乎没有成功用于治疗的新药物产生，很多曾经可以用一种药物治疗的传染病目前已经成为严重的公共卫生安全问题[2]。耐药性，特别是多重耐药菌株的不断出现，给人和动物疾病的治疗带来极大的困难[3]。

目前，常用的耐药性研究方法主要从基因型和表型两方面进行。PCR是常用的基因型检测方法，主要用于检测已知的耐药基因及其突变情况。药物敏感性试验作为表型检测方法，只能检测有限的抗菌药物，且耗时耗力，尤其是某些需要特殊生长环境的细菌[4]。这些传统的分析方法能帮助我们掌握细菌耐药情况，但各有其受限之处。

基因组包含生物体的全部遗传信息，基因组测序技术能够直接反映基因组DNA的遗传信息，不仅为基础研究提供重要信息，也对基因组研究、药物研发和基因治疗等领域产生巨大的推动作用。

1 全基因组测序技术的发展

自上世纪70年代中期第一代DNA测序技术出现，至今已发展出第3代测序技术，30多年期间DNA测序技术已经取得了相当大的进展。

第1代测序技术成本高、速度慢，并不是理想的测序技术，目前采用的主要是2代测序技术，其以高通量、低成本为重要特征，主要包括Roche公司的454测序技术[5]，Illumina公司的Solexa测序技术[6]和ABI公司的SOLiD测序技术[7]。Roche 454技术和Solexa技术是聚合酶合成测序法，SOLiD则是连接酶合成测序法。第2代测序技术虽然在各方面都取得了较大的进展，但由于其是建立在PCR基础上，仍会带来偏差[8]。

目前最新的第3代测序技术是单分子实时测序。Helicos公司推出的遗传信息分析系统(Heliscope/ helicos Genetic Analysis System)[9]、Pacific Biosciences公司推出的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术[10]，标志着第3代测序技术的诞生。与前两代测序技术相比，3代测序技术的成本大大降低。

2 全基因组测序在耐药性分析中的应用

过去十年，测序技术的发展使临床微生物学有了革命性的进展。近来研究表明，全基因组测序分析可能在细菌耐药基因型确定和预测耐药表型中成为一种简单、快速和高效的方法，并且有较高的敏感性和特异性[4]，这使得可培养微生物的耐药性分析实现了“一步法”，且分析周期短于1 d[11]。

2.1 在革兰阴性菌耐药性分析中的应用 Stoesser等[11]利用Illumina HiSeq2000对74株大肠杆菌(Escherichiacoli)和69株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)进行全基因组测序，分析其对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素和美罗培南7种常见抗菌药物的耐药性。将全基因组测序数据用基于BLASTn的方法与包含染色体和质粒的多于100个已知耐药基因的基因库进行比较预测，并与肉汤稀释法得到的表型结果进行比较，结果显示敏感性为0.96(95%CI: 0.94-0.98)，特异性为0.97(95%CI: 0.95-0.98)，并且得到一系列的耐药基因：blaCTX-M、blaLEN、blaOKP、blaOXA、blaSHV、blaTEM、aac(3′)-Ia、aac-(3′)-IId、aac-(3′)-IIe、aac(6′)-Ib-cr、aadA1a、aadA4、aadA5、aadA16、aph(6′)-Id、aph(3′)-Ia、qnrB、qnrS以及染色体上喹诺酮耐药决定区域基因gyrA和parC。

Sima等[12]也利用全基因组测序技术对一株来自黎巴嫩病人的产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯氏菌进行测序分析，并利用RAST在线注释服务器进行自动注释。结果显示该菌株含有不同的β-内酰胺类耐药基因，包括blaOXA-1、blaCTX-M-15、blaSHV-11和blaTEM-1b。此外，该菌株中还检测到其它共存基因，其中最值得关注的是acc(6′)-lb-cr和qnrb1。

Teresa等[13]利用全基因组测序技术对一株多重耐药的海藻希瓦菌(Shewanellaalgae)MARS14的耐药基因组(resistome)和毒力因子进行分析。该菌株对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸和头孢西丁表现耐药，序列分析显示该菌含有ampC和blaOXA-55基因。虽然该菌株对氟喹诺酮类药物(如环丙沙星)表现敏感，但含有qnr4基因。此外，该菌株基因组中还分析得到15种耐药结节分化外排泵、3种多重耐药外排蛋白家族和80种ABC结合超家族。

Zhao等[4]则利用全基因组测序技术对82株空肠弯曲杆菌和32株结肠弯曲杆菌(Campylobacterspp)的耐药基因型进行预测，并评价其与药物敏感性试验得到的耐药表型之间的相关性。结果显示，其中108株四环素耐药菌株全部含有tetO基因，敏感菌株则不含该基因，基因型与表型符合率为100%。同样，萘啶酸/环丙沙星的符合率也为100%。在78株对庆大霉素耐药菌株中，76株含有aac(6′)-Ie/aph(2″)-Ia、aac(6′)-Ie/aph(2″)-If、aph(2″)-Ib、aph(2″)-Ic、aph(2″)-Ig、aph(2″)-If或aph(2″)-Ih基因中的一个，1株含有aph(2″)-If和aac(6′)-Ie/aph(2″)-Ia2个耐药基因。耐药菌株的基因型和表型符合率为98.7%(77/78)，而其敏感性菌株的符合率为100%。当然，也存在其它一些基因型和表型符合率存在差异的情况，如阿奇霉素、克林霉素和泰利霉素。全部菌株基因型和表型的总符合率高达99.2%(1 018/1 026)。

除了常见的革兰氏阴性菌，2015年Nandagopal等[14]对一株来自人血液，表现多重耐药的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)VRFPA09进行测序，发现该菌株含有编码β-内酰胺酶的基因blaVEB-1、blaOXA-10及多重耐药和毒力因子的相关基因。对于已经确定的基因型而言，全基因组测序技术具备直接确定基因型并预测耐药表型的功能。

2.2 在革兰阳性菌耐药性分析中的应用 全基因组测序技术在革兰阳性菌耐药性分析中的应用主要集中在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。WHO将清除结核病的时间定在2035年，而结核分枝杆菌的多重耐药性是完成此目标的最大障碍[15]。利用全基因组测序不仅能够筛选到已知的耐药相关基因簇，还可用来确认潜在性或者未知的基因簇[16]。Timothy等[15]对2 099株结核分枝杆菌的基因组进行了测序，将23个耐药基因作为候选基因，并从算法上将基因突变分为非耐药因子、耐药因子以及未确认因子，评估其预测1 552个独立候选基因组的药物敏感性表型的能力，用于寻找在相似选择压力下除已知耐药因子以外的突变候选基因，从而来解释其余的未解耐药表型。结果确认了120个突变为耐药因子和722个为非耐药因子，其中89.2%的确认表型可以被预测，敏感性和特异性分别为92.3%(95% CI: 90.7-93.7)和98.4%(95% CI: 98.1-98.7)；另外10.8%的表型无法被预测，主要是由于出现未知的突变。大量已知的基因突变使得全基因组测序数据可以在临床中预测耐药或敏感，或者确认不能通过基因型预测的表型。这种方法可以替代药物敏感性试验，并已被应用到常规的诊断过程中以便更快地获取耐药表型。如英国公共卫生组织已将全基因组测序技术作为“一步法”诊断分枝杆菌感染的可能性。全基因组测序在多重耐药的结核病上具备实现“个体化”治疗的潜在可能[17]。Keira等[18]利用全基因组测序对来自夸祖鲁-纳塔尔的337株临床菌株进行分析，以确认结核病的普遍耐药性是最近产生的还是逐渐演化而来。在我国，Zhang等[19]也对一株来自江苏无锡的多重耐药北京/W型结核分枝杆菌(W146)进行测序，该菌株包含几乎所有耐药性关基因及其突变，如rpoB(S531L)、rpsL(K43R)、gidB(E92D)、embB(M306I)以及gyrA基因等。

结核分枝杆菌复合群的全基因组测序数据表明许多地区的结核分枝杆菌突变体具有区域性特征[20]，表明对耐药基因突变进行分类至关重要。目前常用的基于PCR的分类方法需要大量重复性工作，费时费力，并且分辨率较低，无法区分亲缘关系较近的结核分枝杆菌。Hiroki等[21]建立一种基于SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)串联体的针对结核杆菌的在线服务器，CASTB(comprehensive analysis server for theMycobacteriumtuberculosiscomplex，结核分枝杆菌复合群综合分析服务器)，可用于流行病学分析、耐药性预测和系统进化分析(http://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/index.html)。Francesc等[22]则建立了针对15种抗菌药物，包含1 325个突变体的预测性基因库，其中11种抗菌药物已经被792株菌株的全基因组测序数据证明，同时 “TB-Profiler”在线方法也证明该基因库优于其它常规诊断方法和其他已建立的耐药基因库。

除了在结核分枝杆菌中研究较为广泛，全基因组测序技术也在其它革兰阳性菌株中得到应用。如Kok-Gan等[23]对一株来自慢性阻塞性肺炎病人的溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)C10A进行了测序，并利用未加工的基因组序列发现其潜在的多重耐药因子和毒力因子，该菌株包含针对氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、青霉素类、四环素类和糖肽类药物的多种耐药因子。

3 小 结

随着DNA测序技术的迅速发展，其已经在流行病学诊断和药物敏感性预测等方面得到广泛应用，研究对象也由简单的单个或几个基因及其作用转为全基因组的结构和功能。由于耐药性自身及受到环境等外界因素影响的复杂性，传统研究方法已无法满足要求。全基因组测序技术能够分析得到耐药基因及其突变情况，除了已知的耐药机制，还可用于预测未知的潜在耐药机制，耐药基因的表达决定着细菌耐药性，因此该方法可以更好地为解决耐药性问题提供重要参考，全基因组测序技术未来可能超越常规方法成为耐药性研究的首选工具之一，在寻找降低细菌耐药性的新方法和研发新药物中发挥至关重要的作用，并更加广泛地应用到疾病的诊断及治疗中。

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s: Chen Xiang, Email: chenxiang@yzu.edu.cn; Jiao Xin-an, Email: jiao@yzu.edu.cn

Application of whole genome sequencing in bacterial antimicrobial resistance

LI Xiu, QIANG Bin, XU Zheng-zhong, MENG Chuang, CHEN Xiang, JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Bacterial antimicrobial resistance, particularly multidrug resistance, has threaten public health and caused huge economic losses in the world.While many traditional antimicrobial resistance analysis methods are time-consuming, the whole genome sequencing, a new technology, could be a simple, rapid and efficient method applied to antimicrobial resistance analysis with great sensitivity and specificity. In addition to identifying the conventional resistant genotypes and predicting resistant phenotypes, this method may also find the potential resistance mechanisms. This article will review the research progress of whole genome sequencing application in bacterial antimicrobial resistance analysis.

antimicrobial resistance; whole genome sequence; resistance gene

陈 祥，Email：chenxiang@yzu.edu.cn；

焦新安，Email：jiao@yzu.edu.cn

扬州大学, 江苏省人兽共患病学重点实验室, 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009

Supported by the National Department Public Benefit Research Foundation (No. 201403054), the Jiangsu Innovation Program for Graduate Education (No. KYLX_1340), the Qing Lan Project and Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (No. PAPD).

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.003

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A

1002-2694(2016)08-0696-04

2016-05-11；

2016-06-20

公益性行业(农业)科研专项(No.201403054)；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(No.KYLX_1340)；江苏高校‘青蓝工程’和优势学科建设工程项目(No.PAPD)联合资助