3种方法提取辣椒根总RNA的效果比较

孙国胜 马志虎 戴忠良 毛忠良 孙春青 潘跃平

摘 要： 针对辣椒根中富含多糖多酚的特点，比较了Trizol法、改良Trizol法和改良CTAB法3种方法对辣椒根总RNA提取的效果。结果表明，Trizol法、改良Trizol法能提取到辣椒根总RNA，但效果不理想；改良CTAB法提取到的辣椒根总RNA，28 S rRNA的亮度是18 S rRNA的2倍，OD260/OD280和OD260/OD230值分别为1.88和1.80，RNA质量浓度为254.0 mg·L-1；用提取到的RNA进行RT-PCR后可扩增出acting基因特异片段。因此改良CTAB法提取辣椒根总RNA的效果好、质量高、完整性好，能够满足后续试验要求。

关键词： 辣椒根； 改良CTAB法； RNA提取； 比较

Comparison of three methods on total RNA extraction from the root of Capsicum annuum L.

SUN Guosheng， MA Zhihu， DAI Zhongliang， MAO Zhongliang， SUN Chunqing， PAN Yueping

（Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area of Jiangsu Province， Jurong 212400， Jiangsu， China）

Abstract： As the characteristic of rich polyphenol and polysaccharide in the tissue of root in Capsicum annuum L.，three methods including Trizol，optimized Trizol and optimized CTAB to extract total RNA were compared. The results showed that the total RNA with high yields and better quality was extracted by optimized CTAB method that the 28 S rRNA band showed two folds than that of 18S rRNA The ratio of OD260/OD280 and OD260/OD230 are 1.88 and 1.80，the output rate of RNA was 254.0 μg·mL-1. Specific acting gene fragment was amplified by reverse transcription PCR. Above all，the RNA extracted by optimized CTAB method is intact with high quality and output rate. It can be used in following molecular biology experiments.

Key words： Capsicum annuum L.； Optimized CTAB method； RNA extraction； Comparison

高质量的植物组织总RNA是相关分子生物学试验的基础[1]。随着分子生物技术的发展，RNA提取技术已经相当成熟，已有试剂盒可供选择，如Trizol和RNAgents等[2]，但就某些材料而言，单纯的试剂盒或通用技术并不能获得质量好的总RNA[3]，所以找到合适的RNA提取技术至关重要。

叶片或嫩茎等采用常规试剂盒就可以提取到高质量的RNA，但是一些木质化程度高，富含多糖多酚等的植物组织，提取RNA的难度就会大大增加，且有时不会获得理想的RNA[4]。因此针对难提取RNA的材料，需要采用特别或者改进的方法[5]。

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种重要的蔬菜和调味品，是我国种植面积最大的蔬菜之一，种植面积仅次于大白菜，位居第2[6]。笔者在对辣椒黄绿苗突变体（Yellow bud mutant）的叶色变化研究中发现辣椒根富含多糖多酚，不能直接用Trizol法提取总RNA，所以有必要针对富含多糖多酚的辣椒根摸索一套RNA提取方法，以期为后续研究奠定基础。为了解决这个问题，我们比较了Trizol法、改良Trizol法和改良CTAB法[7]提取辣椒根总RNA的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为辣椒‘YBM1106-2黄绿苗突变体，由江苏丘陵地区镇江农科所蔬菜花卉研究室提供。辣椒播种采用50孔穴盘，基质为细河沙，待长出3～4片真叶时取试验材料。

1.2 试剂

Trizol试剂购自Invitrogen 公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氯仿、乙醇、异戊醇、异丙醇、β-巯基乙醇、LiCl和EDTA-Na2·2H2O等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；RT-PCR 试剂购自Takara公司。

2×CTAB提取缓冲液：100 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L-1 EDTA-Na2，1.4 mmol·L-1 NaCl，1%PVP（ω），2% CTAB（ω）。即配置100 mL 2×CTAB提取缓冲液需加：Tris 1.211 4 g，EDTA-Na2·2H2O 0.744 4 g，NaCl 8.181 6 g，PVP 1 g，CTAB 2 g，加RNase Free水60 mL，用4 mmol·L-1 HCl调pH至8.0，用RNase Free水定容至100 mL，65 ℃水浴溶解，122 ℃灭菌20 min。

氯仿/异戊醇为24 ∶1（V/V）；8 mmol·L-1 LiCl （RNase Free水配置，122 ℃灭菌20 min）。

1.3 试验方法

1.3.1 Trizol试剂提取法 （1）取100 mg 辣椒幼根加液氮研磨成粉末，在研钵中加入1 mL Trizol裂解液并置于室温环境下静置5 min，后将其转入1.5 mL离心管中离心10 min（4 ℃，12 000 r·min-1）；（2）取上清液，加200 μL氯仿后涡旋混匀，室温静置2 min，离心10 min（4 ℃，12 000 r·min-1）；（3）取上清液，加入等体积的冰冷的异丙醇，涡旋混匀后室温静置10 min，离心10 min（4 ℃，12 000 r·min-1）；（4）弃上清液，加入1 mL 75%（φ，后同）乙醇，振荡后离心5 min（4 ℃，7 500 r·min-1），移净上清液，开离心管盖室温静置或放置在通风柜中通风10 min，加入20 μL RNAse Free 水溶解后-70 ℃保存。

1.3.2 改良Trizol试剂提取法 裂解液中加入20 μL β-巯基乙醇，并将裂解液置于65 ℃水浴10 min，在研磨后的粉末中加入上述裂解液，其余步骤同Trizol试剂提取法。

1.3.3 改良CTAB提取法 （1）将 CTAB提取液65～70 ℃水浴中预热10 min；（2）取100 mg 辣椒根于液氮环境下研磨成粉末，在研钵中加入900 μL上述CTAB提取液，并加入20 μL β-巯基乙醇，溶化后装入2 mL离心管涡旋30 s后重新放回65～70 ℃水浴中静置5 min；（3）加入900 μL氯仿/异戊醇（24∶1，V/V），涡旋混合后，离心15 min（4 ℃，10 000 r·min-1）；（4）取上清液，加等体积氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）重复步骤3；（4）取上清液于1.5 mL 离心管，加1/3体积 8 mol·L-1 LiCl 4 ℃沉淀过夜或者加入等体积冰冷的异丙醇4 ℃沉淀2 h后离心5 min（4 ℃，12 000 r·min-1）；（5）弃上清液，用500 μL 75%乙醇悬浮沉淀，离心5 min （4 ℃，12 000 r·min-1），弃上清液，用500 μL 100%（φ）乙醇洗涤沉淀，离心5 min （4℃，12 000 r·min-1）；（6）弃上清液，开离心管盖室温静置或放置在通风柜中通风10 min，加入20 μL RNAse Free 水溶解后-70 ℃保存。

1.3.4 总RNA凝胶电泳检测 取2 μL提取的总RNA样品，进行1.2%（φ）琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon，GIS2500）观看RNA条带。

1.3.5 总RNA纯度检测 总RNA纯度检测采用核酸蛋白分析仪（Eppendorf Biophotometre 4G 22331 Hamburg），测定其OD230、OD260、OD280及其浓度。

1.3.6 RT-PCR检测 提取到的辣椒根总RNA经反转录（Takara，M-MLV反转录试剂盒）成cDNA后，采用acting基因进行检测，特异性引物为P1： 5-cgt tga cat ccg taa aga cc-3，P2： 5-aac agt ccg cct aga agc ac-3。反应体系为20 μL，反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后进行1%（φ）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 结果与分析

2.1 辣椒根总RNA凝胶电泳检测

3种辣椒根总RNA提取方法中，改良CTAB法提取到的辣椒根总RNA条带清晰，可明显看到28 S、18 S和5 S共3条特征性条带，且28 S条带明显亮于18 S（约2倍），无拖带现象，说明无DNA、蛋白质及多糖的污染。

Trizol法和改良Trizol法提取到的辣椒根总RNA，也能看到特征性条带，但亮度明显不如改良CTAB法提取到的总RNA，尤其是直接用Trizol法提取到的总RNA，质量差，结果如图1。

A：Trizol法； B：改良Trizol法； C：改良CTAB法。

图1 不同方法提取辣椒总RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 3种方法提取到的总RNA产量及纯度

表1列出通过3种方法提取到的辣椒根总RNA的产量及其纯度，所列为3种样品在紫外分光光度计下测量230 nm、260 nm 和280 nm下的OD值，并计算出相应的OD260/OD280和OD260/OD230，并列出相应样品的RNA浓度。

由表1可见：改良CTAB法提取的辣椒根总RNA 的OD260/OD280和OD260/OD230值分别为1.88和1.80（纯度较高的RNA两个值为1.7～2.0和>2.0），而Trizol法和改良Trizol法提取到的RNA，两个值均比改良CTAB法的小，说明这2种方法提取的RNA受杂质污染严重。

而从RNA质量浓度可见，改良CTAB法提取到的RNA浓度最高，为254.0 mg·L-1，Trizol法和改良Trizol法提取到的RNA含量分别为54.0、95.0 mg·L-1，浓度均低于改良CTAB法。

2.3 RT-PCR检测

对所提取到的辣椒根RNA进行RT-PCR检测，目的是为了验证其是否适宜RT-PCR或其他分子生物学试验，以3种方法提取到的RNA反转录得到的cDNA为模板，用acting基因特异性引物进行PCR检测。结果表明：3种方法均能得到目的条带（约300 bp），但是以改良CTAB法提取到的总RNA为模板的条带明显比其他2种模板得到的条带亮，且亮度差异很大（图2）。试验结果表明：改良CTAB法提取的RNA效果更好，能够有效地满足后续试验要求。

M：Marker； A：Trizol法； B：改良Trizol法； C：改良CTAB法。

图2 辣椒根总RNA RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图

3 讨 论

提取高质量的RNA是进行后续分子生物学试验的基础，辣椒根组织中富含多糖多酚，常规RNA提取方法虽然能够提取到RNA，但是质量不高，影响后续试验。酚类物质在氧化环境下极易被氧化成醌[8]，并且极易与RNA产生不可逆的结合，改良CTAB法提取辣椒根RNA，在提取液中加入PVP，起着多酚螯合剂的作用[9-10]，PVP具有很强的与多酚结合的能力，使其不易被氧化，能够防止多酚与RNA相结合，PVP与酚类物质形成的螯合物在后续抽提中被除去，可有效减少酚类物质的影响。同时β-巯基乙醇作为强还原剂加入到裂解液中，可有效降低酚类物质的氧化[11]。多糖的理化性质与RNA相似，去除多糖的过程中容易将RNA一起去除，难以将其分开[12]，也会造成RNA损失，采用8 mmol·L-1高浓度的LiCl低温沉淀过夜，能专一性的沉淀RNA，但是会损失5 S rRNA，采用冰冷的异丙醇沉淀，亦能得到较高浓度的RNA，本试验采用冰冷的异丙醇沉淀，若需更高质量的RNA，可选用高浓度LiCl过夜沉淀。采用氯仿、异戊醇体积比为24∶1抽提可有效去掉蛋白质，70%（φ）乙醇下RNA不溶解，可有效去除残留蛋白质和多糖，从而得到高质量的辣椒根RNA。

本试验比较了Trizol、改良Trizol及改良CTAB法提取辣椒根总RNA的效果，结果表明，改良CTAB法能够有效地提取到高质量的辣椒根RNA，无论从质量、浓度和RT-PCR结果看，改良CTAB法提取到的辣椒根总RNA均能满足后续分子生物学试验，同时该方法具有操作简单、快速的优点，可供其他富含多糖多酚植物的RNA提取借鉴。

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