动物DNA甲基化的研究现状与应用前景

杨士珍，黄永震，贺 花，2，雷初朝，陈 宏,*

(1. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌，712100；2. 西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌，712100)



动物DNA甲基化的研究现状与应用前景

杨士珍1，黄永震1，贺 花1，2，雷初朝1，陈 宏1,*

(1. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌，712100；2. 西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌，712100)

随着全基因组甲基化测序技术的发展，可以在全基因组范围内确定DNA甲基化的位置及其与基因调控间的关系。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰方式,在维持正常细胞功能、调控个体生长发育起着重要作用，已经成为目前研究的热点。本文综合分析了DNA甲基化的表观遗传学特征，简要介绍了DNA甲基化的作用机制，重点阐述了动物DNA甲基化的研究现状。另外，本文对DNA甲基化研究应用的发展应用前景进行综述。

DNA甲基化；动物；应用

表观遗传是指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达却发生了可遗传的变化，DNA甲基化是其重要的表观遗传修饰方式之一。在动物育种的研究中，动物的某一基因或者生产性状受多种因素的影响和调控，其中，DNA甲基化在动物的正常发育、分化中就起着重要的作用，随着表观遗传学在家畜遗传育种研究中得到广泛关注，DNA甲基化研究的进一步开展，其在家畜遗传育种中发挥的作用也日益显著。

1 DNA甲基化

表观遗传修饰虽然不会引起DNA序列的改变，但是它对器官的发育和个体的生长仍然有重要的影响。DNA甲基化是一种主要的基因组表观遗传修饰方式，在调控基因选择性表达、维持基因组稳定性以及保证机体正常生长发育等生命过程均发挥至关重要的作用。

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，从而将甲基基团连接到DNA分子的碱基上的反应过程[1]。通常情况下，真核生物中的DNA甲基化存在形式主要是5-甲基胞嘧啶(5-mC)，但也存在少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)以及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)[2]。发生DNA甲基化修饰的主要位点是在与鸟嘌呤相连的胞嘧啶上，即聚集成簇的CpG二核苷酸位点，基因组中富含CpG二核苷酸位点的DNA片段被称为CpG岛，而某些基因型更易受DNA甲基化的影响，即对甲基基团更加敏感[3]。DNA甲基化参与了细胞的多种生理活动，比如基因的时空特异性表达、X染色体失活、衰老以及癌症的发生等。

2 甲基化的作用机制

2.1 甲基转移酶的分类及功能

根据目前的研究结果，哺乳动物中与甲基化有关的甲基化转移酶主要有5种：DNMT1，DNMT2，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L[4]。甲基转移酶1(DNMT1)主要在DNA复制时催化新生链上DNA发生甲基化，维持原本存在的甲基化。甲基转移酶2(DNMT2)，其活性很低，该基因缺失对DNA甲基化影响不显著．推断可能不涉及DNA的甲基化，可能诱导RNA甲基化。DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L介导DNA的初始甲基化，即从头甲基化[5]。

2.2 DNA甲基化调节基因表达的机制

DNA甲基化功能的本质是甲基化机制的建立、维持和去除甲基。DNA甲基化调节基因表达的机制主要有两种：①5-甲基胞嘧啶(5 mC)伸入DNA双螺旋的大沟，此处是众多蛋白质因子与DNA结合的部位，且含有丰富的能被转录因子识别的GC序列，但CpG发生甲基化后，转录因子就不能结合到DNA上，从而影响转录因子与启动子区DNA的结合效率；②DNA甲基化导致染色质结构改变，从而抑制基因表达。伴随个体发育，当需要某些基因保持“沉默”时，将迅速发生甲基化，此时基因转录抑制，基因不表达；若需要恢复转录活性，则被去甲基化[6]。

DNA的甲基化主要发生在启动子、转座子、增强子、沉默子和基因本体等部位。通常认为启动子的DNA甲基化对基因的表达有抑制作用，而基因本体的DNA甲基化与基因的表达关系因物种或细胞类型不同而异。增强子的DNA甲基化状态与基因活性呈反比关系，沉默子则相反呈正相关。转座子的DNA高度甲基化抑制其转座活性，从而维持基因组的稳定性[7]。

3 动物DNA甲基化研究现状

3.1 DNA甲基化与肌肉生长发育

家畜个体的肉质是遗传育种中一个重要的性状，在肌细胞分化过程中，表观修饰如DNA甲基化、组蛋修饰和染色质重塑等，都发生了很明显的变化，并受到精确调控[8]。侯伟媛[9]等人在研究Akt基因对肌肉细胞的表观调控时发现，Akt基因的转录水平会增加Dnmtl的蛋白稳定性，上调Dnmt1水平，维持DNA甲基化和染色质结构稳定性，经IL-6处理后的细胞可以观察到Akt能够磷酸化Dnmtl核定位信号肽，激活Dnmtl从胞质向核内转运[10]。

Akt基因还可以通过磷酸化修饰组蛋白甲基转移酶的Ezh2来降低Ezh2与组蛋白H3结合能力，减弱催化甲基化生成的能力，H3K27me3水平减少。而H3K27me3甲基化是非常重要的组蛋白修饰形式，可以调控肌肉分化特异基因表达，使肌细胞分化以及肌管形成顺利进行[11]。

3.2 DNA甲基化与脂肪组织生长发育

近年来的研究发现[12],DNA甲基化在脂肪组织生长发育过程中发挥了重要作用:DNA甲基化可以调控脂肪细胞分化转录因子、转录辅助因子以及很多脂肪组织特异性基因的表达,从而调控脂肪组织的生长发育。

研究发现，脂肪组织中PPARγ启动子的DNA甲基化程度在不同发育阶段是不同的,且健康动物和肥胖动物PPARγ启动子的DNA甲基化存在差异。脂肪组织PPARγ启动子DNA甲基化的升高导致其mRNA表达下降[13]。这说明脂肪组织中DNA甲基化存在差异，而DNA甲基化在脂肪细胞分化过程中同样发挥着重要的作用[14]。研究发现,在脂肪细胞分化过程中DNA甲基化是动态变化的[15]。脂肪细胞分化受到转录因子调控网络的精细调控,目前已发现DNA甲基化能调控多个脂肪细胞分化的转录因子、转录辅助因子基因的表达。例如，脂肪细胞分化的重要转录调控因子之一的C/EBPα，在前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,C/EBPα基因启动子区的CpG甲基化水平有升高的现象。

3.3 DNA甲基化与胚胎生长发育

一般认为胚胎发育过程是多种因素的共同结果，其中DNA甲基化起着重要作用。研究表明，DNA甲基化在生殖细胞形成早期至胚胎发生中经历了一系列动态变化：精子形成早期，来自父方的印记全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，在进行减数分裂时，此类特异性的修饰可随之进入到精细胞，虽然其对DNA一级结构没有影响，但会使特异性基因表达发生变化。卵细胞也具备同样变化[16]。受精卵在植入子宫前的最初几次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上从亲代遗传下来的甲基化标志，在胚胎着床之后，除了具备CpG岛启动子区域之外，所有基因都会重新进行一次剧烈的甲基化，并在随后的发育过程中，组织特异基因经历选择性去甲基化而形成特异表达细胞类型[17]。

3.4 DNA甲基化与细胞癌变

在转录开始时，可通过对CpG岛(启动子区域)甲基化作用进行基因表达调控，正常状态时，非甲基化的CpG岛被广泛的表达，而在癌变细胞里，此类非甲基化状态的CpG岛却被甲基化修饰。利用去甲基化剂5-氮胞昔对组织细胞进行处理时，可令DNA去甲基化并使某些基因染色体发生重组现象，对基因去甲基化是使得组织细胞基因不稳定易发生癌变的一类原因[18,19]。单基因水平及基因组范围内的DNA甲基化改变在细胞癌变中亦发挥重要作用。抑癌基因的异常甲基化引起的表达抑制,可导致肿瘤细胞的增殖失控和侵袭转移,在许多肿瘤的研究中也都发现了基因组整体DNA低甲基化所导致的染色体不稳定性。

4 DNA甲基化的应用前景

4.1 DNA甲基化在转基因克隆技术上应用前景

目前，低效率的体细胞核移植技术显著制约着该技术在转基因动物生产上的广泛应用，而克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程,主要是表观遗传修饰的变化，而DNA甲基化是其最主要的方面。

基因的甲基化状况(特别是启动子区域)有调控基因表达的作用,异常的DNA甲基化表观修饰引起的基因表达异常有可能是克隆动物表型异常和缺陷的原因[20,21]。根据研究发现[22]，转基因克隆过程可能会引起胎盘中印迹基因的DNA甲基化的不完全重编程使胎盘发育失败,进而可能导致了克隆动物器官发育异常以及死亡。苏建民等[23]研究利用亚硫酸氢盐测序法和亚硫酸氢盐联合限制性内切酶法对印迹基因PEG10在转基因克隆牛胎盘上的甲基化状况进行了研究。结果显示PEG10在围产期死亡且有发育缺陷的转基因克隆牛的胎盘上的DNA甲基化程度异常高,而存活组表现出较为正常的DNA甲基化程度。

由此可见，研究此过程中的DNA甲基化并且实现人为控制DNA甲基化和去甲基化及特定基因位点甲基化和去甲基化在转基因克隆技术中非常重要。

4.2 DNA甲基化在诱导多能干细胞技术上的应用前景

DNA甲基化作为一种关键的表观遗传因素,能够维持细胞长期的表观遗传记忆,在细胞重编程中具有重要作用[24.25]。目前的研究表明,体细胞被诱导为iPSCs的过程中经历了一系列有序的生物学事件,包括外源基因的表达、全基因组组蛋白修饰的改变、间充质细胞向上皮样细胞的转化(Mesenchymal-to-epithelialtransition,MET)、内源多能性转录因子的激活和全集因组DNA的去甲基化等[26]，所以在诱导体细胞重编程中，DNA甲基化是一个重要障碍。探索DNA甲基化与去甲基化确切的分子机制是理解其在体细胞诱导重编程中作用的基础，研究细胞是如何在确保某些基因发生去甲基化的同时, 而又使另外一些基因发生重新甲基化是进一步探索DNA甲基化在细胞重编程过程中作用的关键，也是诱导多能干细胞技术在动物生产上广泛应用的关键。

4.3 DNA甲基化在动物遗传育种上的应用前景

近年来，DNA甲基化被作为一种新的分子遗传标记在动物遗传育种上的应用研究主要集中在下面几个方面：(1)用来预测畜禽杂种优势；(2)可以作为检测动物生长性状、胴体性状的辅助选择标记。杂种优势本质上源于亲子代基因的差异表达[27]。此外，DNA甲基化也会影响畜禽生长性状和胴体性状。Xiong等[28]发现杂交种DNA甲基化降低与基因表达增强有关，可能与杂种优势表达有关。总体甲基化程度与杂种优势无关，而特异位点上的甲基化的改变对杂种优势有显著效应。研究表明，胴体性状在个体中性甲基化百分差异水平之间均无显著的差异(\%P\%>0．05)；瘦肉率和瘦肥肉比例在个体全部甲基化百分差异水平之间存在显著的差异(\%P\%<0．05)；胴体重、肩部最厚处背膘厚、平均背膘厚和骨率在个体特殊甲基化百分差异水平之间存在显著的差异(\%P\%<0．05)。

由此可见，DNA甲基化作为一种新的分子遗传标记在动物遗传育种上有着长远和十分重要的应用意义。在将DNA甲基化作为分子标记补充应用于生产实际时应针对不同性状，将杂种后代甲基化控制在适当的水平，从而能够生产出质优效高的畜禽产品，提高畜牧业生产的经济和社会效益。

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Research and Application of DNA Methylation in Animal Genetics and Breeding

YANG Shi-zhen1, HUANG Yong-zhen1, HE Hua1, 2, LEI Chu-zhao1, CHENG Hong1*

(1KeyLaboratoryofagriculturalmolecularbiology,Collegeofanimalscienceandtechnology,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100; 2,Collegeofanimalmedicine,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling,Shaanxi712100,Shaanxi,)

With the development of whole genome methylation sequencing technology, the location of DNA methylation and its relationship with gene regulation can be determined in the whole genome wide range. As an important epigenetic modification, DNA methylation plays an important role in maintaining normal cell function and regulating the growth and development of individuals, and has become a hot research topic in the present study. In this paper, we comprehensively analyze the epigenetic characteristics of DNA methylation, briefly introduce the mechanism of DNA methylation, and focus on the research status of DNA methylation in animal. In addition, this paper summarizes the problems in the application of DNA methylation research, as well as the prospects for the development of the application.

DNA methylation; Animal; Application

2016-07-01

2016-07-10

本项目由国家肉牛牦牛产业技术体系专项(CARS-38)资助，中国博士后科学基金面上项目(2015M570857, 2015M570856)，陕西省科技统筹创新工程计划项目(2015KTCL02-08，2014KTZB02-02-02-02)，西北农林科技大学2015年大学生创新创业训练计划项目资助完成。

杨士珍(1995-)，女，河北张家口人，主要从事动物遗传与育种研究。

S823

A

1001-9111(2016)05-0051-04

*通讯作者：陈宏 (1955-)，男，陕西西安人，教授，博士生导师，主要从事分子遗传与家畜育种。