制备液相色谱法分离纯化恩拉霉素预混剂中恩拉霉素A和恩拉霉素B

唐阳刚* 李敬辉徐新军黄洁云

（1 丽珠集团新北江制药股份有限公司，广东 清远 511500；2 中山大学药学院，广东 中山 510000）

制备液相色谱法分离纯化恩拉霉素预混剂中恩拉霉素A和恩拉霉素B

唐阳刚1* 李敬辉1徐新军2黄洁云2

（1 丽珠集团新北江制药股份有限公司，广东 清远 511500；2 中山大学药学院，广东 中山 510000）

目的 建立从恩拉霉素预混剂中分离纯化恩拉霉素A和恩拉霉素B的制备高效液相色谱（Pre-HPLC）方法。方法 采用正丁醇与酸水反复萃取，利用Pre-HPLC方法对恩拉霉素精制品中的恩拉霉素A和恩拉霉素B进行分离纯化。结果 用紫外、质谱和核磁共振法进行结构确证，经分析型HPLC检查，恩拉霉素A和恩拉霉素B的纯度均达98.0%以上。结论 由该法制备恩拉霉素A和恩拉霉素B简便、快速，所得产物纯度高，适合于其对照品的制备。

恩拉霉素；制备液相色谱法；分离纯化；恩拉霉素A；恩拉霉素B

恩拉霉素（enramycin）又名安来霉素、恩霉素、持久霉素，是一种由链霉菌发酵产生的多肽类抗生素，已被世界上许多国家正式批准为抗生素饲料添加剂［1-3］。作为饲料添加剂，恩拉霉素具有优良的促生长和改善饲料利用率的作用，同时具有稳定性高，肠道内不易降解，无交叉耐药性，无残留等优点。在当前食品安全事件频发的情况下，恩拉霉素因其广谱、高效和安全而引起人们的关注［4-5］。

恩拉霉素是一种由氨基酸分子和脂肪酸分子组成的有机碱类，其中氨基酸分子组成环状多肽结构，脂肪酸分子位于多肽结构末端。由于脂肪酸分子的不同，得到A、B两种组分，恩拉霉素即为这两种组分的混合物。恩拉霉素A和恩拉霉素B结构非常相似，难于分离制备，目前国内尚无恩拉霉素A、恩拉霉素B对照品，恩拉霉素的研究及质量控制、监督管理中所需对照品依赖进口，价格昂贵。本实验通过采用反相高效制备液相色谱从恩拉霉素中分离纯化得到恩拉霉素A和恩拉霉素B，为产品的质量控制、质量监督、测试方法评价、化学量制溯源提供参考。

1　仪器和试剂

SHIMADZU HPLC仪，含SIL-20A型进样器，SPD-20A紫外检测器，LC-20AT泵，LC solution工作站（日本岛津公司）；Mettler toledo AL-204万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB25-12DTD型超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16B安科离心机（上海安亭科学仪器公司）；RE-3000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Bruker Autoflex Ⅲ smartbean基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪（德国BRUKER公司）；Bruker AV600超导核磁共振波谱仪（德国BRUKER公司）。

8%恩拉霉素预混剂（批号：1101002，丽珠集团新北江制药股份有限公司），乙腈、甲醇（B&J）为色谱纯，水为Milli-QRG纯水系统制备的超纯水（美国Millipore公司）。乙醇、正丁醇、乙醚、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠（天津大茂）均为分析纯。

2　方法和结果

2.1样品制备：取8%的恩拉霉素预混剂约100 g，加入500 mL的60%乙醇搅拌均匀，用2 mol/L HCl（约90 mL）调pH至3，超声提取30 min，减压过滤。在滤液中加入约2 g活性炭后于水浴中煮沸15 min脱色，过滤除去活性炭，将滤液减压旋转蒸发至无醇味（约300 mL），将浓缩后的溶液用2 mol/L NaOH调节pH至8，转移到分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取，每次100 mL，萃取3次，合并正丁醇层，用100 mL水洗正丁醇层，重复操作一次。正丁醇层用100 mL pH为3的稀盐酸水进行反萃取，同法共萃取3次，合并酸水层，用2 mol/L NaOH调节所得酸水层pH至7.5～8，加100 mL水饱和的正丁醇萃取，重复3次，再用100 mL正丁醇饱和的水洗正丁醇层2次，将水洗后的正丁醇层减压浓缩至小体积，加入100 mL乙醇共沸脱水，向脱水后的样品中加入20 mL乙醚，放置于冰箱过夜，离心后得到类白色无定形沉淀，40 ℃减压干燥12 h得类白色粉末作为供试品。

2.2色谱条件

2.2.1制备型HPLC。色谱柱：GRACE-Apollo C18（150 mm×10 mm，5 μm）；流动相：甲醇（B）-0.5%醋酸（A）（35∶65，v/v）；流速：4 mL/min；柱温：室温；进样量：1 mL；检测波长：267 nm。

2.2.2分析型HPLC。色谱柱：Phenomenex Luna C18（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（B）-0.05 mol/L磷酸二氢钠（A）（30∶70，v/v）；流速1 mL/min；柱温：室温；进样量：10 μL；检测波长：267 nm。

2.3纯品的制备：取恩拉霉素样品约1 g，用15 mL pH=3的50%甲醇超声5 min，经4000 r/min离心，取上清液经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液进样，进行高效液相制备色谱分离，按上述制备色谱条件洗脱，收集7.8～9.5 min和14～16 min两段组分。

2.4制备组分的纯度检查：取收集的两份制备组分溶液按“2.2.2”项下分析HPLC条件进样，经面积归一化法计算，化合物A的纯度为99.23%，化合物B的纯度为98.86%。将纯度大于98%的经化合物A和化合物B分别以40 ℃旋转蒸发仪真空浓缩至干，用甲醇超声溶解，过滤，置于真空干燥箱内40 ℃减压挥干，最后得到2种类白色粉末。

2.5结构鉴定。化合物A：类白色粉末，UV（MeOH）λmax nm：231，272 nm；质谱［MALDI-TOF/MS（m/z）］：m/z为：2355.891；其UV、MS与恩拉霉素A文献报道［7］一致。化合物B：类白色粉末，UV（MeOH）λmax nm：231，272nm；质谱［MALDI-TOF/MS（m/z）］：m/z为：2369.945；，其UV、MS与恩拉霉素B的文献报道［7］一致。

3　讨 论

3.1由于样品为预混剂，含大量发酵用培养基及敷料，因此需要进行必要的前处理，根据恩拉霉素易溶于酸水，调整碱性后溶于水饱和正丁醇这一性质，试验中采用正丁醇与酸水反复萃取的方法获得以恩拉霉素A和恩拉霉素B为主的样品。

3.2高效制备液相色谱法分离制备化合物不仅能够得到高纯度的化合物单体，而且产率高，操作方便，便于收集，制备出的产品可作为对照品。该色谱分离方法为在抗生素中分离高纯度的化合物单体提供了参考。

［1］Higashide E，Hatano K，Shibata M，et al.Enduracidin，a New Antibiotic I，S treptom yces fungicidicus No.B5477，an Enduracidin Producing Organism［J］.Antibiotics，1968（21）：126-137.

［2］Asai M，Muroi N，Sugita H，et al.Enduracidin，a New Antibiotic II.Isolation and Characterization［J］.Antibiotics，1968（21）：138-146.

［3］顾欣，蔡金华，刘雅妮，等.饲料中恩拉霉素的微生物学含量测定方法研究［J］.中国兽药杂志，2008，42（9）：17-21.

［4］卜仕金.多肽类抗生素饲料添加剂——安来霉素［J］.中国兽医杂志，2003，39（4）：48-50.

［5］万文倩，杨文革，胡永红.微生物检测法 测定安来霉素发酵液生物效价［J］.饲料检测，2010（3）：41-43.

［6］周岷江，严玉宝，胡娟，等.恩拉霉素的研究进展［J］.中国兽药杂志，2007，41（12）：42-44.

［7］黄萍，万有能，邓红，等.恩拉霉素在动物生产中的应用进展［J］.四川畜牧兽医，2010（10）：29-30.

R917

B

1671-8194（2016）26-0022-02

2012年清远市产学研结合项目（项目编号：2012D021211001）

E-mail： tangyanggang@livzon.cn