黑莓杂交优株的SSR指纹图谱鉴定

张春红，卫云丽，吴文龙，马　兵，李维林

(1. 中国科学院江苏省植物研究所，江苏　南京　210014；2. 南京中植农业科技开发有限公司，江苏　南京　211225)

黑莓杂交优株的SSR指纹图谱鉴定

张春红1，卫云丽1，吴文龙1，马兵2，李维林1*

(1. 中国科学院江苏省植物研究所，江苏南京210014；2. 南京中植农业科技开发有限公司，江苏南京211225)

摘要：运用SSR分子标记技术，对来自相同或不同亲本的6个黑莓潜力杂交组合优株进行了分子鉴定，确定指纹图谱。结果表明，78对SSR引物中共有25对在4个亲本品种中具有多态性。将各自在不同杂交组合亲本中具有多态的引物用于优株鉴别，发现Kiowa×Arapaho组合中的3个优株有12对亲本间呈多态的引物可以鉴别，优株10-2n-1有6对扩增为杂合带型，10-2n-2和10-2n-5均有5对，其余则偏父本或母本一方，且有5对引物可以区分3个优株；来自Chester×Kiowa组合的优株10-5n-2在18对多态引物中多扩增为双亲重组类型，推测其性状可能多介于双亲之间；来自Hull×Kiowa组合的优株10-6n-1-1和10-6n-1在6对多态引物扩增结果中，10-6n-1-1多继承了父本的带型，而10-6n-1扩增多显示为双亲杂合带型。鉴定结果为育种中相同亲本杂交组合黑莓优株区分提供了依据，也一定程度上揭示了黑莓杂交重组中的复杂性和不确定性。

关键词：黑莓；杂交优株；SSR标记；DNA指纹图谱

文章编号：1001-7380(2015)05-0001-05

收稿日期：2015-09-18;修回日期：2015-09-21

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目“早熟、无刺、小籽黑莓优良品种选育”(CX[14]2021)；中植农业科技创新基金“优质无刺早熟黑莓新品系筛选与展示”(201401)

作者简介：张春红(1979- )，女，山东菏泽人，副研究员，博士，从事黑莓生物技术育种工作。E-mail：chzhang0714@163.com。

通信作者：*李维林(1966-)，男，陕西汉中人，研究员，主要从事悬钩子属植物利用研究。

中图分类号：S663.2

文献标志码：A

doi:10.3969/j.issn.1001-7380.2015.05.001

DNA fingerprinting identification of blackberry hybrid

strains with SSR molecular markers

ZHANG Chun-hong1, WEI Yun-li1, WU Wen-long1, MA Bing2,LI Wei-lin1*

(1.Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China;

2. Nanjing Zhongzhi Agricultural Science and Technology Development Co. Ltd., Nanjing 211225,China)

Abstract：Using SSR molecular markers, DNA fingerprints of six potential hybrid strains from the same or different hybrid parents were identified. The results showed that 25 of the 78 pairs of SSR primers had polymorphism in the four parent varieties. After the polymorphic primers for parents of different hybrid combinations were further used for superior strain identification, for the hybrid combination of Kiowa×Arapaho, three superior strains could be identified by 12 SSR pairs which performed polymorphic between parents. The superior plant 10-2n-1 showed heterozygous bands by six pairs’ amplification while 10-2n-2 and 10-2n-5 both had five pairs. The bands for the rest primers were all same to the father or mother and five pairs of primers could discriminate three superior strains. There was one superior plant 10-5n-2 selected from the hybrid combination of Chester×Kiowa, which could be identified from the parents by combination of 18 pairs of polymorphic primers. Thus it was speculated that the traits of 10-5n-2 might be between the parents. Superior plants 10-6n-1-1 and 10-6n-1 were from the same hybrid combination Hull×Kiowa. By amplification of six pairs of SSR polymorphic primers, 10-6n-1-1 mainly inherited the male parent and 10-6n-1 tended to display parents’ heterozygous bands. The identification of different strains of the same hybrid combination not only provided the basis for distinguishment between superior plants in future’s blackberry breeding but also partly revealed the complexity and uncertainty in blackberry hybrid breeding.

Key words：Blackberry (Rubus sp.); Superior hybrid strain; SSR marker; DNA fingerprint

黑莓(Blackberry)是蔷薇科悬钩子属(Rubus)的一种特色浆果类果树，因其果实富含花青素和维生素E而成为极具发展潜力的特种经济林树种[1]。黑莓自1986年由江苏省·中国科学院植物研究所引进以来，为江苏低山丘陵地区的开发和农民增收做出了贡献[2]，但由于适生品种单一、企业配套滞后及工业污染等，使其产业发展也面临困境[3]。目前国外对适于生产的优良新品种的保护尤为重视，国内很难引进理想的品种类型，培育具有自主知识产权的黑莓新品种迫在眉睫。

国内自开展黑莓引种以来，不仅进行了适应性栽培和鲜果的开发利用[4]，也开展了一系列杂交组合配制[5]和品种选育[6]研究，但由于悬钩子植物遗传背景较为复杂及不同倍性种质的亲和性较低致使常规育种工作进展较慢。SSR(Simple Sequence Repeats)又称简单序列重复，是20世纪80年代发展起来的一种新型DNA标记，具有可靠性强、重复性好、多态性丰富、呈共显性等优点，在不同树种上被广泛用于优株辅助选择[7]、亲本确认[8]及资源比较鉴定[9]。在品种鉴定方面，本课题组利用已报道的部分SSR标记对黑莓杂交品种宁植2号进行了亲本确认[10]。

在江苏现有表现较好的黑莓引进品种中，Kiowa具有生长量最大、单果最重和产量最高的特性，但枝蔓有刺[11-12]，Arapaho最早熟但产量很低，Chester高产、果实硬度大但因晚熟而易遭遇高温梅雨天气，Hull高产但果实较小[12]。为适应当前黑莓发展需要，理想的育种目标应集无刺、早熟和优质高产为一体。在通过多种杂交组合配制、初步选出表现性状较好的优株基础上，本研究利用悬钩子SSR标记引物进一步检验各优株在遗传特性上的表现，以及对来自相似或相同亲本的不同早熟无刺优株加以区别，以期为确定优株亲本来源及为育成品种指纹图谱鉴定提供依据。

1材料与方法

1.1　研究材料

黑莓试验材料取自江苏南京溧水白马农业科技园区，为4个亲本品种(Hull，Chester，Arapaho 和Kiowa，来源如图1)及6个杂交优株(10-2n-1，10-2n-2，10-2n-5， 10-5n-2， 10-6n-1和10-6n-1-1)。取黑莓幼嫩叶片，置于-70 ℃保存备用。

1.2　DNA提取

各材料基因组DNA提取采用CTAB法，具体过程参照文献[13]。

1.3　SSR引物合成

所用的78对SSR引物，4对来自红树莓品种‘Meeker’(Rubusidaeus)，8对来自黑莓杂交品种‘Marion’[14]，其余66对来自红树莓品种‘Glen Moy’(RubusidaeusL. subspidaeus)[15]。引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.4　SSR-PCR反应及电泳分析

SSR-PCR反应体系和反应程序参照文献[10]。所用Taq酶和Marker产品分别购自百泰克生物(北京)和东盛生物(广州)。扩增反应在Labnet TC9600-G-230V PCR仪上进行，结束后产物经由8%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=19∶1)120 v/cm电泳1.5 h，置于0.2%AgNO3中染色10 min，加入含0.5%甲醛(V∶V)的1.5%NaOH溶液显色15 s，条带清晰后终止反应，记录与分析。

图1　黑莓杂交组合亲本品种系谱

2结果与分析

2.1　亲本的SSR引物扩增产物多态性

首先利用78对引物对4个亲本品种进行了扩增，筛选出了多态性引物。各引物产生的DNA片段中仅考虑扩增量最多、染色最深的主带，结果显示78对引物在4个亲本中有5对没有扩增到清晰条带，其余73对可扩出清晰条带，其中25对在4个亲本中具有多态性(占比32.05%)(见表1)，主带扩增片段大小为70~500 bp。

2.2　杂交优株的SSR引物扩增产物多态性

利用表1中所列的25个多态性引物对4个亲本品种和6个杂交优株进行同时扩增，对各杂交组合及其杂交优株的扩增产物分别统计，进一步筛选多态引物，结果见表2。3个杂交组合中以Chester×Kiowa的多态性引物最多，有18对引物的扩增条带在双亲及其杂交优株10-5n-2间显示差异。杂交组合Hull×Kiowa的多态性引物最少，仅有6对引物的扩增条带在双亲及其杂交优株10-6n-1和10-6n-1-1间有差异。

表1　黑莓亲本品种的多态性SSR引物及其序列

表2　黑莓亲本品种及其杂交优株的SSR引物多态性

2.2.1Kiowa×Arapaho组合中亲本及其杂交优株的SSR扩增结果12对多态引物对杂交优株10-2n-1，10-2n-2和10-2n-5及其母本Kiowa和父本Arapaho的扩增结果如图2。P4引物的扩增结果显示3个优株为母本和父本杂交而来，其中10-2n-1和10-2n-5扩增带型相同，10-2n-2则相对2者有带缺失；P7引物表明10-2n-1与父本带型相同，10-2n-2和10-2n-5带型相同且与母本相同；P13引物对3个优株的扩增带型均与母本相同；P15引物显示为10-2n-5与母本相同，10-2n-1和10-2n-2分别遗传了父本和母本的部分条带；P16引物显示为3个优株虽为双亲杂合类型但均有不同条带缺失；P24引物显示3个优株均与父本相同；P25引物显示为10-2n-1与母本带型相同，其余2者与父本相同且均有条带缺失；P39引物显示3个优株带型均不同，虽证明为双亲杂交但有条带缺失；P40引物扩增10-2n-1与父本相同，10-2n-5与母本相同，10-2n-2为双亲杂合带型；P55引物扩增10-2n-2与父本相同，10-2n-1和10-2n-5均为双亲杂合带型；P59引物显示为10-2n-1为双亲杂合带型但有缺失，10-2n-2中有父本部分带型，10-2n-5条带缺失严重；P60引物扩增10-2n-2为双亲杂合带型，10-2n-1和10-2n-5虽为双亲杂合带型但均有条带缺失。总体来看，12对引物中，10-2n-1在6对中显示为杂合类型，10-2n-2有5对，10-2n-5有5对，其余则偏父本或母本一方。另一方面，黑莓遗传背景具杂合性和复杂性，杂交过程中染色体重组和变异明显，导致3个优株部分杂合条带在重组中丢失。实验结果也显示，可以区分3个优株的SSR引物有P15，P39，P40，P55，P59和P60。

P4~P60为12对多态引物；5个泳道1组，从左至右分别为母本Kiowa，父本Arapaho，10-2n-1，10-2n-2和 10-2n-5；M，DNA ladder图2　12对SSR引物对优株10-2n-1，10-2n-2和10-2n-5及其双亲的扩增图谱

2.2.2Chester×Kiowa组合优株扩增结果18对多态引物对杂交优株10-5n-2及其母本Chester和父本Kiowa的扩增结果如图3。P6，P7，P21，P51，P75等引物的扩增结果显示10-5n-2带型与母本Chester相同，P28的扩增结果显示10-5n-2带型与父本Kiowa相同，P2，P13，P14，P46，P50，P60，P61等引物的扩增结果显示10-5n-2为双亲杂合类型，可将父母本及优株加以区分。而P55，P59，P73等引物的扩增结果也显示优株为双亲杂合带型但有不同程度条带缺失，引物P31和P40呈现与父本部分相同但又有新条带出现。总体来看，10-5n-2总体多扩增为双亲重组类型，推测其性状可能介于双亲之间。

P2~P75为18对多态引物；3个泳道1组，从左至右分别为母本Chester，父本Kiowa和10-5n-2；M，DNA ladder图3　18对多态引物对优株10-5n-2及其双亲的扩增图谱

2.2.3Hull×Kiowa组合优株扩增结果6对多态引物对杂交优株10-6n-1-1和10-6n-1及其母本Hull和父本Kiowa的扩增结果如图4。P2引物对10-6n-1-1的扩增结果显示了母本的部分条带，10-6n-1显示为双亲杂合带型；P6引物的扩增结果显示为 10-6n-1-1与父本相同，10-6n-1为父母本杂合类型但有条带缺失；P7引物的扩增结果显示为10-6n-1-1和10-6n-1分别与父本和母本带型相同；P13和P14引物的扩增结果显示2个优株带型相同且均为双亲杂合类型；P17引物扩增结果显示10-6n-1-1与父本带型相同，10-6n-1为双亲杂合类型。从6对引物扩增结果总体来看，2个杂交优株中，10-6n-1-1继承了较多的父本的特征，10-6n-1显示为双亲杂合类型，与植株表型观察的结果基本一致。

P2~P17为6对多态引物；4个泳道1组，从左至右分别为母本Hull，父本Kiowa，10-6n-1-1和10-6n-1；M，DNA ladder图4　6对多态引物对优株10-6n-1-1和10-6n-1及其双亲的扩增图谱

3讨论与结论

SSR标记因具有共显性和多态性高的特点，作为第2代分子标记已被广泛用于农作物和林木品种的鉴定以及苗木真实性和纯度的检测[16-17]。由于黑莓遗传背景相对复杂，分子生物学研究相对滞后，国外近年来关于黑莓SSR分子标记的研究也仅见于少量报道[14,18]，且主要用于遗传图谱构建[19]和遗传多样性分析[20]。本课题组之前利用78对已报道的SSR引物对黑莓杂交品种宁植2号进行了分析，仅发现7对引物在亲本间具有多态性，且其中6对引物的带型与母本相同，证明黑莓具有高度杂合的遗传背景[10]。本研究从78对引物中共检测到25对在6个杂交优株及其亲本中显示多态，利用这些多态性SSR引物分别检测了各杂交优株及其亲本的遗传特点，结果显示10-2n-1，10-2n-2的10-2n-5的多个位点为双亲杂交类型但条带丢失明显；10-5n-2为双亲重组类型，其性状可能多介于双亲之间；10-6n-1-1继承了较多的父本带型，而10-6n-1显示为双亲杂合带型，这些结果不仅在一定程度上反映了杂交优株的遗传背景，也为进一步评价这些优株及杂交选育提供了借鉴。

在配制的3个杂交组合所用的4个亲本品种中，Hull和Chester均由美国马里兰州Beltsville试验中心选育，查询其系谱完全相同(见图1)，2品种母本和父本基本均由黑莓品种配制而来。尽管如此，但Hull×Kiowa和Chester×Kiowa组合在相同的SSR引物下扩增结果差异明显，且相同引物扩增的优株扩增条带也有不同之处，一定程度上反映了黑莓杂交重组中的复杂性。Kiowa和Arapaho品种均由美国阿肯色州Fayetteville黑莓育种试验站选育，其亲本也由多个黑莓品种配制，且含有相同的Darrow和Brazos黑莓品种成分(见图1)。2品种配制的组合Kiowa×Arapaho获得的杂交优株扩增结果既显示杂合带型又显示条带缺失或异常，表明黑莓不仅具有高度杂合的遗传背景，在杂交配制和基因重组中性状会严重分离，杂交后代的表现存在不确定性，育种中要优选到理想个体需尽可能增大杂交组合基数。此外，本研究采用的SSR引物开发自不同悬钩子中的红树莓和黑莓品种[14-15]。3个杂交组合中F1优株的扩增带型有的呈显性而有的呈共显性特征，也表明不同遗传背景下的悬钩子开发的SSR引物的适用性值得深入评价，要通过指纹图谱准确鉴定育成品种也需开发其自身的SSR引物。

参考文献：

[1]Bernadine C, Tohn R C, Chad E F, et al. Worldwild blackberry production[J]. HortTechnology, 2007, 17(2): 205-213.

[2]吴文龙, 陈岳, 闾连飞, 等. 黑莓、树莓在南京地区的引种研究[J]. 江苏林业科技, 2006, 33(2): 13-15, 20.

[3]李玮, 王小敏, 张有才, 等. 南京溧水黑莓产业发展现状与应对策略[J]. 山东林业科技, 2012 (1): 100-106.

[4]孙醉君, 顾姻, 蔡剑华. 黑莓引种十年的回顾与展望[J]. 江苏林业科技, 1998, 25(3): 46-48, 54.

[5]吴文龙, 闾连飞, 李维林, 等. 黑莓品种间杂交及与野生悬钩子种间杂交初步研究[J]. 东北农业大学学报, 2013, 44(7): 123-127.

[6]王小敏, 吴文龙, 张春红, 等. 黑莓杂交F1代初选优株的调查与分析[J]. 经济林研究, 2012, 30(3): 91-95.

[7]Ruiz C, Paz Breto M, Asíns M J. A quick methodology to identify sexual seedlings in citrus breeding programs using SSR markers[J]. Euphytica, 2000, 112(1): 89-94.

[8]Moriya S, Iwanami H, Okada K, et al. A practical method for apple cultivar identification and parent-offspring analysis using simple sequence repeat markers[J]. Euphytica, 2011, 177:135-150.

[9]Gross-German E, Viruel M A. Molecular characterization of avocado germplasm with a new set of SSR and EST-SSR markers: genetic diversity, population structure, and identification of race-specific markers in a group of cultivated genotypes[J]. Tree Genetics & Genomes, 2013, 9(2): 539-555.

[10]张春红, 胡淑英, 间连飞, 等. 黑莓优良品种宁植2号及其亲本的SSR鉴定[J]. 江苏农业科学, 2012, 40(12): 44-46.

[11]闾连飞, 黄钢, 吴文龙, 等. 不同品种黑莓在南京地区的生长表现[J]. 经济林研究, 2008, 26(3): 74-79.

[12]吴文龙, 闾连飞, 李维林, 等. 不同品种黑莓在南京地区的结实表现[J]. 林业科技开发, 2008, 22(4): 24-29.

[13]贾静波, 李维林, 吴文龙, 等. 悬钩子属植物的RAPD分析[J]. 植物资源与环境学报, 2008, 17(3): 18-22

[14]Castillo N R F, Reed B M, Graham J, et al. Microsatellite markers for raspberry and blackberry[J]. Journal of The American Society For Horticultural Science, 2010, 135(3): 271-278

[15]Graham J, Smith K, MacKenzie K, et al. The construction of a genetic linkage map of red raspberry (Rubusidaeussubsp.idaeus) based on AFLPs, genomic-SSR and EST-SSR Markers[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 109(4): 740-749.

[16]王燕龙, 姜言生, 曲志才, 等. SSR分子标记在作物种质资源鉴定中的应用[J]. 山东农业科学, 2012,44(10): 11-18.

[17]殷继艳, 张建国. SSR标记技术在杨属植物研究中的应用[J]. 四川林业科技, 2009, 30(2): 25-29.

[18]Lewers K S, Saski C A, Cuthbertson B J, et al. A blackberry (RubusL.) expressed sequence tag library for the development of simple sequence repeat markers[J]. BMC Plant Biology, 2008, 8(1):69.

[19]Castro P, Stafne E T, Clark J R, et al. Genetic map of the primocanefruiting and thornless traits of tetraploid blackberry[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2013, 126(10): 2521-2532.

[20]Dossett M, Bassil N V, Lewers K S, et al. Genetic diversity in wild and cultivated black raspberry (RubusoccidentalisL.) evaluated by simple sequence repeat markers[J]. Genetics Resources and Crop Evolution, 2012, 59(8):1849-1865.