玉米抗旱性功能基因研究进展

高志勇，谢恒星，王志平，刘史力

(1 渭南师范学院化学与环境学院，陕西渭南 714099； 2 陕西省河流湿地生态与环境重点实验室，渭南 714099)

玉米抗旱性功能基因研究进展

高志勇1，2，谢恒星1，2，王志平1，2，刘史力1

(1 渭南师范学院化学与环境学院，陕西渭南 714099； 2 陕西省河流湿地生态与环境重点实验室，渭南 714099)

介绍了干旱及其对玉米的影响，概述了玉米抗旱性功能基因克隆方法和技术的研究进展，包括全基因组关联分析、候选基因关联分析、转录组研究及蛋白质组研究等研究方法及进展。展望了玉米基因功能研究的发展前景。

玉米；抗旱性；功能基因

玉米有着古老的种植和培育历史，是三大粮食作物(水稻、小麦、玉米)之一。培育玉米优良品种，增强其抗旱性，与其产量紧密相关，目前有着重要的现实意义。玉米抗旱性包括干旱屏蔽和耐旱性两个方面。高等植物主要通过干旱屏蔽方式抵抗水分胁迫，其表现如玉米、水稻等植物，在干旱条件下出现叶片卷曲，以减少水分丢失。有些植物则是通过气孔内陷，产生蜡质保护性物质，叶片减小或退化，以减少蒸腾作用；有的则是使根系分布广而深，输导组织发达，增强对水分的吸收及运输，有利于保持植物的水分平衡，避免发生水分亏缺。在许多较低等的植物，如苔藓、地衣等中，可通过耐旱性方式抵抗干旱，其机理是它们的原生质具有能忍耐脱水而不受永久性伤害的能力。大多数高等植物(除种子及花粉外)耐旱性很弱。目前，深层次挖掘玉米本身存在的抗旱分子机制研究仍旧十分缺乏，玉米抗旱性以及一些重要农艺性状基因克隆进展缓慢，这方面的研究亟需开展，以促进玉米的遗传育种工作，获得优质高产的抗旱性玉米品种。

1 干旱对玉米生长的影响

干旱是指由于长时期的降水偏少，造成空气干燥，土壤缺水，植物体内的水分相应发生亏欠，影响了植物体的正常生长发育，从而引起减产的一种农业气象灾害。在当今世界，干旱问题非常严重，地球土地的总面积中，约有35%属于干旱及半干旱地区；而在世界总耕地面积中，干旱及半干旱地区更是占了43.9%[1]。在旱地作物中，玉米对水分胁迫非常敏感，生长中需水量较大，在整个生长周期内，一般需要至少2500 mm的降水量，而且生长期内的需水量变化很大，除苗期可适当干旱(蹲苗)外，从拔节到成熟都应保证良好的水分供应[2]。因此，在引起干旱及半干旱地区玉米减产的诸多因素中，干旱是最主要的非生物逆境胁迫因子[3]。我国每年种植的玉米中，受到干旱影响的面积占了大约60%，造成减产20%～30%。玉米不同的发育期受干旱的影响不同。就产量而言，开花期受干旱的影响最大，而苗期和灌浆期受影响的程度相对小一些。品种间基因型有所不同，受到的影响也有较大的不同。因此，进行玉米的抗旱相关基因和抗旱的遗传和生理基础研究，进而挖掘抗旱性相关基因资源，从而选育出高抗旱性品系，是解决干旱对玉米生产影响的长远之计[4]。

2 玉米功能基因克隆方法

基因是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的物质基础。不论是要揭示某个基因的功能，还是要改变某个基因的功能，都必须首先将其克隆出来。特定功能基因的克隆，是整个基因工程或分子生物学的起点。目前玉米功能基因的克隆中，主要采用以下几种方法。

2.1 全基因组关联分析

全基因组关联分析在玉米基因研究上有重要作用。玉米是花单性的雌雄同株作物，其遗传多样性非常高，在其基因组中，有着非常丰富的遗传变异，目前公用数据库中，仅SNP标记，就已经超过了一百万。为了寻找优良抗旱相关基因，采用关联分析方法，能对玉米抗旱能力的遗传基础进行剖析。近些年来，应用关联分析方法，已在研究玉米抗旱性方面取得了较大的进展。利用热带和亚热带共350个自交系组成的关联群体，研究了全基因组范围内不同代谢途径、生殖生长发育和抗逆响应有关的候选基因，已开发了共1536个SNP标记，并将来源于540个候选基因的1229个SNP标记进行了关联分析，包含已报道和脱落酸以及碳水化合物代谢途径有关的基因115个；在水分胁迫环境中，花期检测到3条染色体上有4个候选基因的SNP，与脱落酸或蔗糖含量显著关联[5]。

目前，测序技术和高通量芯片等其它基因组分析技术正在快速发展，大量获取全基因组SNP标记或重测序数据已不再是技术限制因素。基于全基因组重测序或高密度芯片检测，进行玉米等复杂性状全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)的基因发掘，已取得很大进展。人工创造的高油玉米是研究基因组进化的特异材料。该研究利用包含高油玉米的368份玉米自交系为材料，利用RNA-seq方法进行了籽粒发育期的转录组大规模测序，挖掘出了103万SNP，获得了28 769个基因的表达量数据，同时分析了两年4点的籽粒油分相关性状。基于全基因组关联分析，共发现74个座位与籽粒油分相关性状显著关联，其中1/3的座位编码油脂代谢的关键酶；鉴定出了26个与籽粒总含油量显著相关的座位，能解释83%的表型变异。这项研究还发现，人工长期选择的高油玉米仅在有限基因组位点发生改变，有利等位基因的累加可能是高油玉米油分增加的主要原因。该研究还发掘出一些玉米油分相关性状的有利等位基因，从全基因组水平较深入地解析了玉米籽粒油分的遗传基础，为认识高油玉米的遗传结构变异提供了理论基础，对进一步改良玉米油分的含量和质量有重要指导意义。

当前利用全基因组测序基因分型(Genotyping-by-Sequencing，GBS)方法，在玉米基因功能研究方面，也取得了迅速进展，获得了大量的玉米基因组学信息，采集了约20亿个全基因组信息数据，完成了4000份材料基于测序的基因型分析工作，这其中约500个系还具备较完备的耐旱性评价资料。

2.2 候选基因关联分析

研究中，只对可能影响目标性状的基因进行功能鉴定，以验证其等位变异，是否控制了目标性状并发掘出优良的等位基因，这是候选基因关联分析的主要研究内容。候选基因关联分析，需要充分利用连锁分析、突变分析、生化途径和比较基因组学等方法所提供的信息，来寻找候选基因，通过在关联群体中对候选基因进行重测序，来检测多态性位点与目标性状的关联。该方法在玉米维生素A、番茄红素环化酶和β胡萝卜素羟化酶等方面，已取得了显著研究进展。在玉米实验中，用106份玉米自交系，扩增出了平ivr2基因全长DNA序列，并进行了序列多态性分析。利用候选基因关联分析的方法，在正常水分和干旱胁迫条件下，对产量及构成因素进行分析，共检测到48对标记和性状显著关联，并推测基因488位点与玉米耐旱性相关[6]。9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶和RAB28在脱落酸生物合成和干旱应答上起着积极作用。实验用196份自交系为材料扩增nced和rab28基因全长DNA序列，在海南三亚和新疆乌鲁木齐进行大田抗旱性鉴定共考察20个形态、产量及产量组成性状，利用候选基因关联分析的方法，nced和rab28基因在水分胁迫下分别检测到13个和11个多态性位点和目标性状显著关联，该结果有助于进一步开发抗旱功能标记和分子育种[7]。以3个重组自交系和305个自交系组成的关联群体，用2052个SNP进行基因型鉴定，以ASI为抗旱性鉴定指标，发现结合连锁和连锁不平衡的联合作图能提高QTL定位的检测效率，整合定位比单独定位多定位到18个QTL，而用单倍型分析可以进一步提高定位效率，并定位到编码SET结构域蛋白和酸酮还原酶2个候选基因[8]。

2.3 转录组分析研究

利用基因表达谱分析，可以对干旱胁迫下相关基因的表达水平进行研究，探索与胁迫响应相关的基因调控网络，可能有助于确定与抗旱相关的候选基因。研究用2个抗旱和1个敏感的墨西哥玉米地方品种，对干旱胁迫和恢复灌溉前后基因表达水平进行研究，发现抗旱品种的基因表达水平变化幅度比敏感品种大，尤其在恢复灌溉后差异最为明显，显示抗旱品种在水分胁迫后能更有效地激活抗旱相关基因的表达[9]。实验中利用cDNA微阵列技术，对水分胁迫下玉米籽粒发育过程中胎座和胚乳的基因表达水平进行分析，与对照组相比，胎座中有79个基因的表达水平发生了明显的变化，其中89%的基因表达表现为上调变化，这其中多为热激蛋白、分子伴侣和结构蛋白；胚乳中有56个基因的表达水平发生明显的变化，其中82%的基因表现为下调表达，其中多数和细胞分裂及生长有关[10]。利用IBM Syn10双单倍体群体和寡核苷酸芯片技术，对玉米根部所有基因的表达水平进行表达QTL分析，鉴定了大量的cis和trans QTL，同时探讨了假阳性和假阴性的问题，并精细定位和图位克隆了一个与脱落酸8'-羟化酶表达有关的顺式QTL，推测谷酰胺转氨酶是一个主要的候选基因[11]。从B73和H99组配的120个重组自交系群体中，挑选出了抗旱能力差异最大的2个抗旱系和2个敏感系，利用芯片技术，对正常水分和水分胁迫下授粉10 d后玉米籽粒中基因的表达水平进行研究，发现有252个基因显著受到干旱胁迫影响，通过遗传和电子定位有88个差异表达的基因定位到连锁图上，并与抗旱相关性状QTL定位的结果进行比较，有22个差异表达的基因定位在抗旱性相关QTL区域，推测是重要的抗旱候选基因[12]。

Fernandes等[13]利用基因芯片的方法，在多种逆境胁迫环境中，研究B73的基因表达谱变化，从得到的实验结果看出，同正常条件相比，模拟干旱处理(11%的甘露醇处理)条件下，共有349个基因发生了下调表达，128个基因发生了上调表达。其中有40个基因在干旱、盐和低温条件下都下调表达，而有17个基因在这3种逆境下都表现上调表达。这些在3种逆境条件下都上调或下调表达的基因，可能处于玉米对不同逆境胁迫响应基因表达调控网络的关键位点，对于玉米在抗逆性方面的改良具有重要作用。Zheng等[14]利用基因芯片的方法，对优良耐旱自交系Han21和对干旱敏感的自交系Ye478进行研究，从实验结果看出，在水分胁迫环境中，参与ABA信号途径的信号传输相关蛋白PP2C (蛋白磷酸酶2C，ABA信号途径的负调控因子)、SnRK2、Vp14(与AtNCED3同源，是ABA合成的关键酶)等基因，参与活性氧清除的酶和转录因子(DREB2、NAC)等基因受到显著的诱导调控表达。其中水分胁迫环境中，两个材料中差异表达的基因共有827个，其中与离子转运、蔗糖转运、细胞壁纤维素合成相关酶类、果胶脂酶等基因对于两个自交系的耐旱性差异可能具有重要的作用。但是仅根据基因表达谱的研究结果，尚不能确定差异表达的基因对于特定玉米自交系耐旱性的提高是否具有正向效应；通过基因芯片的方法研究基因表达谱的变化，不能检测出在玉米干旱胁迫过程中表达丰度较低但可能具有重要作用的调控类蛋白基因；通过基因芯片的方法不能检测出不同自交系间在耐旱相关同源基因在拷贝数上的差异。目前，RNA测序技术(RNA-Seq)的应用已经彻底改变了转录组学方面的认识。RNA测序又称为转录组测序，是新近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术。该技术能够在单核苷酸水平上对物种的整体转录活性进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现一些位置的转录本和稀有转录本，精确识别可变剪切位点以及编码区的单核苷酸多态性，可以提供更为全面的转录组信息。相对于基因芯片技术，RNA-Seq技术无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录谱变化进行检测，能提供更加精确的数字化信号、更高的检测通量和更广泛的检测范围。

2.4 蛋白质组分析研究

在生物体中，蛋白质直接执行各项生理功能，控制着所有生命活动，因此，只从DNA和mRNA水平对植物的抗旱功能进行研究，得出的结论尚不够全面。目前，高通量的蛋白质组学研究方法不断发展，像2D双向电泳和质谱分析，使得可以对蛋白质的表达水平进行定量分析。但是在蛋白质组水平上研究玉米抗旱相关基因的报道还比较少。实验中，对正常水分和干旱胁迫下，不同时间段(4～14 d)玉米叶片基部蛋白质表达水平进行定量分析，结果显示有46种蛋白质表达水平显著增加，但是不同蛋白质的表达模式有着差异，且在不同自交系中也不一样，因此推测一些蛋白质表达水平的差异，可能与玉米抗旱性相关[15]。

了解作物干旱的响应机制，是抗旱性基因型育种的第一步。在中度干旱条件下，分析两个对脱水反应敏感性相反基因型的玉米。在敏感的玉米品种中，生理参数的分析揭示了气孔导度降低，伴随着相对含水量轻微的降低。与此相反，甚至在脱水条件下，抗性基因型保持气孔张开和明显的光合作用。双向凝胶电泳和iTRAQ两个独立方法分析了干旱引起的叶片蛋白质组变化，从而提供了一致但部分重叠的结果。干旱导致这两种基因型保护和与胁迫有关的蛋白质上升(主要是伴侣和脱水蛋白)。两种基因型在各种解毒蛋白水平的差异与观察到抗氧化酶活性的变化相对应。在敏感基因型，保护蛋白质的上调种类和水平通常较低，这意味着合成蛋白处于较低水平，同时也表明蛋白翻译系统的成分特异变化。基于这些结果，认为敏感基因型超敏感的气孔早期关闭，导致光合作用的抑制，并随后与耐旱有关的保护/解毒蛋白合成效率降低。

3 展望

总体看来，在玉米的抗旱性研究上，形态指标和生理指标是比较传统的方法，虽然在玉米抗旱QTL定位上也取得了一些进展，克隆了一些抗旱基因，但还远没有揭示出复杂的玉米抗旱机制，这方面的工作亟需加强。当前，玉米突变体的创制和筛选，玉米突变体库的构建，玉米抗旱基因的克隆，基因功能的揭示，玉米抗旱性的基因表达调控网络的进一步解析等乃是当务之急，这也是一个长久且艰巨的任务，并将对作物抗旱研究及育种实践起到极大的推动作用。

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Advances in Research on Functional Genes of Drought Resistance in Maize

GAO Zhiyong1，2，XIE Hengxing1，2，WANG Zhiping1，2，LIU Shili1

(1 School of Chemistry and Environment，Weinan Normal University，Weinan，Shaanxi 714099，China； 2 Key Laboratory for Ecology and Environment of River Wetlands in Shaanxi Province，Weinan，Shaanxi 714099，China)

Drought and its impact on maize were introduced.Overview was made about the cloning methods and technology research progress of the maize drought resistant functional gene，including genome-wide association analysis，candidate gene association analysis，transcriptome research，proteome research methods and progress.The development prospects of the research on the function of maize gene were prospected in the end of the paper.

maize； drought resistance； functional genes

2016-08-09

高志勇(1966-)，男，博士，副教授，研究方向：植物分子生物学，Email：shandonggaozhiyong@126.com。

陕西省教育厅2016年重点科学研究计划项目(16JS031)；渭南师范学院理工类人才基金项目(2015ZRRC02)；渭南师范学院科研计划项目(15YKF003)。

S513.01

A

1001-5280(2016)06-0732-04

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.06.31