血凝和血凝抑制实验浅谈

雷蕾 （辽宁省沈阳市动物疫病预防控制中心 110034）

血凝和血凝抑制实验浅谈

雷蕾 （辽宁省沈阳市动物疫病预防控制中心 110034）

血凝和血凝抑制实验在实际操作中被广泛的使用，主要是因为进行该实验时步骤流程简单，不需要长时间的等待实验结果，最为重要的是实验结果在很大程度上具有代表性，能够为人们所接受。通过实验既能起到保护动物健康的作用，同时，又能为养殖户提供禽类疾病的预防，文中结合实际经验叙述该实验的方法及注意事项，具有非常重要的现实指导意义。

环境温度；血凝；血凝抑制

1 血凝和血凝抑制实验理论和方法

何谓血凝和血凝抑制？前者主要是病毒与血液中的红细胞发生的凝集。当发生凝集现象时，在反应中加入具有抑制作用的物质来阻止凝集，这就是血凝抑制。通常这种物质是具有特异性的血清。不管是两种实验中的哪一种，其主要的检测对象都是血清抗体。血凝实验的对象一般是选取一种或者是两种以上的动物，在具体的实际操作过程中所采用的是标准抗原同鸡红细胞。为了达到实验效果，将病毒或者是还有血凝素的病毒加入抗原同鸡红细胞中，二者之间就会发生凝集作用。

相较于血凝实验，要想达到抑制凝集反应的效果，首先要做的是在含有病毒的悬液中加入一些抗体。为了保证实验效果，对这些抗体有一些客观上的要求，一方面要具有特异性，另一方面是在实验量上的保证，要确保能够达到抑制效果。否则，就会出现红细胞继续发生凝集反应。

2 被检样品

2.1 采样

（1）首先确定实验对象的范围，然后采取一定的抽样方法选取检测样本。在保证所采集的样本能够充分代表整个实验对象的前提下，通过随机抽样的方式按照不同的标准进行样本采集。对属于同一批次的，按照3%的比例随机抽样。对样本的采集数量也有一定的要求，必须不能少于30，如果低于这个样本数量的话，那么实验检测出来的结果是不具有代表性的。

（2）对所抽选的样本进行采样后，要在第一时间内送检。如果出现特殊情况影响了送检安排，就必须按照要求对采样标本进行预处理，要严格掌控血清分离的时间。在实验中，要非常注意对时间的把握。如果分离的时间过长的话，会降低抗体的效价。

2.2 被检血清

在采集完样本后，为了达到能够自然析出血清的效果，我们在实验中要完成以下两个步骤：一是将采血器向后回抽2～3ml，二是在前一步骤的基础上留出空隙，将呈放血清的容器按照一定的角度进行放置。在实验过程中，要充分考虑到外部环境的温度因素。如果实验是在夏天进行的话，那么就可以将其放在室内。如果是冬天，应该将温度控制在37℃，要在室内进行析出。如果样本中出现了血清不易分离的现象，或者是成胶冻状的话，那么说明所采集的血清抗体含量不均匀，这将会给实验结果带来非常大的误差。在实验中，对已经分离好的血清按照不同的情况进行处理。如果能够在短期内检测，如一周以内，那么就将样本血清放在4℃冰箱内保存；如果要等待较长的时间，那么就应将样本血清存放在-20～-80℃的冰箱内，而且在对样本运输的过程中，要确保温度的适宜，可以用冰块来满足样本血清对温度的需求。

3 反应板

（1）在反应板的选择上，选用可以一次性使用的96孔V型板。实验过程中，首先要确保板的质量合格，如果不合格，会严重造成实验结果偏差。还要充分保持反应板及凹孔的干净，除了干净之外，还要保证板的平整度，实验过程中不能有任何的失误。反应板放置的角度也会影响到实验的结果，主要是因为放置角度的不同会在一定程度上影响红细胞的沉降速度，角度的过大或者是过小，会产生不同的结果。

如果实验中选取的不是一次性使用的反应板，那么在重复使用反应板的过程中，要做好反应板的清洁工作，没有清洁干净的反应板会造成实验结果的不可靠。如果呈放样本血清的容器中有红血球残留的话，那么会给这两种实验带来不同的影响，对血凝实验，会造成效价偏低，而对抑制实验，会造成相反的结果。

（2）在实验过程中，要保证反应板在一定时间内的静止，不能出现晃动。如果在实验中，我们对反应板进行过多地操作的话，不停地将其拿在手中进行观察的话，会严重的影响实验的凝集效果，这样就会造成血凝实验效价偏低，而抑制实验结果偏高。因此，在进行这两种实验时，要有一定的耐心，给实验充足的反应时间，不急于一时，只有这样才能保证两种实验的效果。

4 抗原效价的测定及配制

4.1 抗原的保存

一般在进行这两种实验时，所用的抗原是有两种不同形态的，液体和干粉。但是不管是以哪种形态存在，都应该将其设定在-20℃的温度下进行保存。在进行抗原效价测定时，为了获得更好的实验效果，可以将同样的抗原进行混合使用，而且进行多次实验，通过多组实验结果的对比，进行适当的平均，以使得实验结果更加有效可靠。

抗原的血凝价如果出现以下情况时，会使得效价降低。比如外部温度变化频繁。在实验中，如果出现已经测定好血凝价的抗原有多余的情形，应该将多余的抗原重新装置，一般将其放置到经过杀菌处理后的离心管中。装置完以后，要在管上标明相关基本信息，时间和效价，以便下次实验中继续使用。在存放过程中，切忌反复冻融，如果抗原多次这样操作的话，会使得血凝抑制滴度提高，一般血凝价相差的滴度与血凝抑制价相差的滴度相一致。

4.2 稀释液

实验中所用的稀释液在酸碱性上有非常具体明确的要求。应采用酸碱值为7.2的PBS缓冲液。之所以会以这样的标准进行选取，主要是为了让红细胞能够更加容易的发生自凝。如果采用酸碱值过高的稀释液的话，那么会造成凝集的红细胞洗脱加快，使得凝集价检测偏低，凝集抑制价偏高。实验的每一步操作都是为了提高实验结果的可靠性。在PBS液的配制上，尽量做到什么时候用什么时候进行调制。在时间方面，要严格掌控稀释液的配制时间。长时间暴露在周围环境中，会使得稀释液受到污染，这样会滋生细菌，给实验结果造成偏差。

5 温度对实验值的影响

在整个实验过程中，环境温度起到了一个至关重要的作用。在一定的温度范围内，血凝和血凝抑制的滴度会随着温度的提高相应的作出提高反映。如果室温出现在低于4℃时，红细胞会发生自凝。同时，外部环境的温度会影响到实验的反应速度。如果温度过高，使得反应在短时间内就完成，不容易被观察记录。实验证明，在37℃时，实验结果出现的最快，随着温度的升高，会出现反应物解离和红细胞溶血现象。反应过程尽量在恒温箱中进行，要求恒温箱温度能精确保持设定温度。

正常实验在20～25℃的条件下进行。在实验开始30min后，对实验中产生的现象进行观察记录，然后，每隔一段时间记录一次，在不断的观察记录对比过程中，直到出现最佳观察结果为止。

6 体会

在整个实验过程中，除了外部环境温度会对实验结果产生影响，还有其他非常细节的因素也会左右实验结果。每个影响因素的存在既是独立又是交织在一起的。所以，在实验中，我们一定要严格遵守实验操作规则，尽可能的排除人为因素对实验结果的影响。我们可以通过多组实验的重复操作，来减少实验中出现的偏差；同时，在进行实验时，我们的实验人员要有过硬的专业技术和实践经验，只有做好每一步，才能保证实验结果的可靠，为实践提供现实指导。