牛羊包虫病实验室诊断技术的研究进展

孙 雨，王晓英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，赵柏林，石 慧，宋晓晖

（中国动物疫病预防控制中心，北京102600）

专论与综述

牛羊包虫病实验室诊断技术的研究进展

孙 雨，王晓英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，赵柏林，石 慧，宋晓晖

（中国动物疫病预防控制中心，北京102600）

包虫病是由寄生于犬、狼、狐狸等动物小肠的棘球绦虫中绦期（棘球蚴）感染中间宿主而引起的一种严重的人与动物共患寄生虫病。其确诊除需要常规的临床诊断外，还依赖于血清学、分子生物学以及影像学等实验室诊断方法。文章从包虫病的流行病学特点、细粒棘球绦虫的结构及生活史、包虫病的实验室检测和诊断技术进行综述，并对实验室诊断技术确诊包虫病的前景进行了展望，以期为包虫病的临床快速诊断和深入研究提供一定的参考。

包虫病；流行病学；实验室诊断

包虫病（hydatidosis）是由棘球绦虫的幼虫寄生于人及牛羊猪等多种哺乳动物的肝、肺等内脏器官，成虫寄生于犬、狼、狐等食肉动物肠道所致的人畜共患寄生虫病［1］。包虫病呈全球性分布，尤其以放牧或半农半牧为主要畜牧业生产方式的国家为主。该寄生虫的蚴体生长力强，体积大，不仅压迫周围组织使之萎缩和功能障碍，还易造成继发感染，如果蚴体包囊破裂，可以引起过敏反应，甚至导致死亡，严重威胁公共安全和畜牧业生产，影响社会经济发展［2］。我国政府高度重视包虫病的防控工作，农业部将其列为二类动物疫病，卫生部将其列入丙类传染病。包虫病防治工作目前存在防控手段单一、流行区域流行形势复杂、缺乏防控技术规范等问题，已经

成为一个世界性的难题。2010年，农业部、卫生部等14个部委联合印发了《防治包虫病行动计划（2010—2015年）》，极大地推动了我国包虫病防控工作进展。但由于包虫病流行区经济和社会发展水平相对滞后，地理环境复杂，自然条件恶劣，宗教习俗多样，农牧民群众科学文化知识普及率较低，防治机构和队伍不健全，动物宿主种类多、数量大、分布广、管理难度大等因素，我国包虫病防控工作仍然面临诸多困难和巨大挑战。本文从包虫病流行特点、细粒棘球绦虫的结构及生活史、包虫病的检测和诊断技术的研究进展进行综述，以期为包虫病的临床快速诊断和深入研究提供一定的参考。

1　病原特征

1.1病原分类

包虫又名棘球绦虫（Echinococcu spp.），在分类上属于带科（Taeniidae）、棘球属（Echinococcus）。棘球属包含5个种，即细粒棘球绦虫（E.granulosus）、多房棘球绦虫（E.multilocularis）、石渠棘球绦虫（E.shiquius）、少节棘球绦虫（E.oligarthtus）和福氏棘球绦虫（E.vogeli），我国以前3个种较为多见［3-9］。其中对人畜危害最严重的为细粒棘球绦虫，可分为多个基因型，包括羊种（G1、G2）、牛种（G3、G5）、马种（G4）、骆驼种（G6）、猪种（G7）及G8，以及在波兰的猪上发现的第9基因型（G9）和在欧亚的驯鹿上发现的第10基因型（G10）。在我国主要流行细粒棘球绦虫G1基因型［10-13］。

1.2病原的基本形态特征

棘球绦虫的成虫长度2～7 mm，由头节和3～4个节片组成。头节上有4个吸盘，顶突上有36～40个小钩。成虫的孕节内含有一套雌雄同体的生殖器官，生殖孔位于节片侧缘的后半部。孕节的长度远大于宽度，约占虫体长度的一半，并有多对子宫侧枝，内部充满虫卵。包虫的蚴体为包囊状构造，内含液体。棘球蚴的形状常常因寄生部位的不同而有变化，一般近似球形，直径5～10 mm。棘球蚴的囊壁分为两层：外层为乳白色的角质层，内层为胚层，又称生发层，前者由后者分泌而成。胚层向囊腔芽生出成群的细胞，这些细胞空腔化后形成一个小囊，并长出一个小蒂与胚层相连。这些小囊能够生成数量不等的原头蚴，因此这些小囊又被称为育囊或者生发囊［1］。

2　流行病学特征

2.1传染来源与传播途径

人、绵羊、山羊和牛等中间宿主的感染多因直接接触犬和狐狸，经口感染虫卵，或因吞食被虫卵污染的水、草、食物和蔬菜等而感染；工人在处理和加工狐狸与狼的皮毛时也容易感染该病。犬科动物主要是食入了带有棘球蚴的动物内脏组织器官而感染该病。人感染包虫病主要是通过消化道传入，也有报道称虫卵能与尘埃混合随风通过呼吸道传入人体内［14-16］。该病还可以通过破损的皮肤以及胎盘感染给人。我国甘肃曾报道过阴道包虫病的病例，在卫生习惯不良的情况下，虫卵带入阴道被分泌物消化，在经细微损伤直接植入阴道粘膜下，逐渐形成了阴道包虫病［1］。

2.2易感宿主

人、绵羊、山羊、牛和猪等家畜均是较敏感的中间宿主，其中人和绵羊较为易感。该病寄生于动物内脏器官和全身脏器中，尤其寄生于肝和肺脏，犬和犬科动物是该病的终末宿主，寄生于小肠［17］。

2.3棘球绦虫的生活史

棘球绦虫寄生于犬、狼、狐狸的小肠，虫卵和孕节随终末宿主的粪便排出体外，中间宿主随污染的牧草和饮水吞食虫卵后而感染。虫卵内的六钩蚴进入中间宿主体内后在消化道孵出，钻入肠壁，随血流或淋巴散布到体内各处，以肝和肺内最为常见。在中间宿主机体内，虫卵经过6～12个月的生长可成为具有感染性的棘球蚴。犬、狐狸等终末宿主吞食了含有棘球蚴的脏器后即得到感染，经过40～50 d发育为细粒棘球绦虫，成虫在犬、狐狸等动物体内的寿命为5～6个月［18-20］。

2.4流行与分布

包虫病呈全球性分布，尤其以畜牧业（如羊、牛等）为主的国家较为严重。中国、蒙古、土耳其、土库曼斯坦、叙利亚、黎巴嫩、阿根廷、巴西、智利、澳大利亚、新西兰以及非洲一些国家均是包虫病的重要流行国家［21］。其中对畜牧业危害最为严重的细粒棘球绦虫有着不同的基因型，包括羊种（G1、G2）、牛种（G3、G5）、马种（G4）、骆驼种（G6）、猪种（G7）及G8，第9基因型（G9）在波兰的猪上发现，第10基因型（G10）在欧亚的驯鹿上发现［22］。羊种G1虫株目前是最易感染人的，也是世界上分布最广的，其在羊上的高感染率表明其也是感染人的基因变异型，与人间在摩洛哥、突尼斯、肯尼亚、哈萨克斯坦、阿根廷及中国西部的高流行性一致［23］。我国是人畜棘球蚴病高发国家之一，主要由细粒棘球绦虫引起。目前在我国有10种有蹄家畜均有不同程度的感染：绵羊、山羊、牦牛、黄羊、水牛、骆驼、马、驴、骡以及猪，其中绵羊受感染的程度最为严重，受威胁最大。自1905年我国青岛首次报道人体棘球蚴病以来，现已在23个省、自治区和直辖市发现原发的人和动物棘球蚴病，其中新疆、青海、甘肃、四川、宁夏、内蒙古和西藏呈严重的地方性流行，为我国棘球蚴病高发区。我国包虫病的流行区人群平均患病率1.08%，囊型包虫病病灶出现突然破裂，可致过敏性休克而死亡，而未经治疗的泡型包虫病患者10年病死率高达94%，被称为“虫癌”［24］。

3　实验室诊断技术

3.1酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（ELISA）是近几年关注较多的一种检测包虫病的方法，并有可能取代皮内变态反应试验，用于样品的大规模初筛检测［25］。对中间宿主开展免疫诊断时，可用囊液、抗原B（AgB）、粗提原头节蛋白为包被抗原进行ELISA检测。尤其是抗原AgB具有非常好的免疫原性，能够识别出80%包虫病患病动物，同时它在调节宿主免疫应答反应中也具有很重要的作用。目前使用的检测包虫病的ELISA方法大多为间接ELISA方法，其优点是快速、简便、可用于大规模定性检测。但由于AgB抗原具有明显的变异和多态性。同时差异分子生物学结果显示，AgB在寄生虫生活史的不同阶段的表达存在差异，所以AgB作为抗原包被用于ELISA检测动物血清，其敏感性较差，还需检测方法辅助进行确证［26］。

3.2皮内变态反应

皮内变态反应是一种速发型变态反应，用于检测包虫病时操作简单，并且可在短时间内观察结果，一般认为其阳性检出率可达90%以上，但特异性较低，不同寄生虫病之间有明显的交叉反应。因此，皮内变态反应不能作为确诊的依据，也不宜用于疗效考核，只能在流行区对可疑患病动物起过筛作用［27］。

3.3免疫PCR法

免疫PCR法（immuno-PCR）是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色［20］。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。这种方法比酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶免疫法（ELA）等传统方法更灵敏。Immuno-PCR识别一抗和二抗的灵敏度高达108。Immuno-PCR由待测抗原、生物素化抗体、亲和素 （连接分子）、生物素化DNA、PCR扩增5部分构成。目前主要用于检测肿瘤、细胞因子、神经内分泌活性多肽、微生物抗原、各种活性酶、衣原体和各种寄生虫等微量抗原。该方法用于包虫病诊断的优点是可以提高其诊断的特异性和敏感性。缺点是该方法尚处于研究阶段，配套试剂尚缺乏，在检测寄生虫领域也属于摸索阶段，试验的条件、优化方法和程序需要进一步完善。

3.4环介导等温扩增法

环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换型DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在恒温65℃左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法。该技术已开始广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测，以及进出口快速诊断中，并得到了世界上许多国家的认同［28］。LAMP方法在检测包虫病方面的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。其缺点是该方法灵敏度非常高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重，建议在进行试剂盒的研发过程中采用实时浑浊仪，不要把反应后的PCR管打开。同时该方法对引物设计要求也比较高。

3.5抑制差减杂交法

抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术是基于抑制PCR和差减杂交技术建立的简单有效的方法，通过一次差减杂交可使低丰度的序列（mRNA）得以高于1 000倍的富集，有效地选择性扩增目标序列，同时抑制非目标序列的扩增，因此在分离基因特别是分离低丰度差异表达基因方面具有更广阔的应用前景［20］。在转录水平上研究基因表达的技术，具有稳定、高效、可靠的特点，可对生物的生长、发育、衰老、死亡等生命过程及生物或非生物逆境胁迫对生物所造成的影响等进行全面、系统的分析。该方法便于应用在寻找与寄生虫不同发育阶段相关的差异表达基因和与寄生虫抗药性相关的差异表达基因，以及其他相关基因的研究，如与不同虫株、不同宿主或性别差异相关的基因［29］。在细粒棘球绦虫发育过程中，可通过此技术得到不同发育期差异表达的基因，并将这些基因用于诊断和防治包虫病。该方法是一种高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术，其优点是高效、便捷和假阳性率低，在检测包虫病方面有一定的应用前景。但是，目前在寄生虫学研究中的应用不是很多，因为SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析，对于多个样品则无能为力，这在很大程度上限制了它的应用。

3.6实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR（quantitative real-time，QPCR）技术是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。该方法在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计监测整个PCR过程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析［20，30］。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。目前实时荧光定量PCR法主要包括荧光嵌合法和荧光探针法两种。该方法已经广泛应用于食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业微生物等检测领域。国内外寄生虫领域的学者也开始使用该方法检测包虫病。该方法的优点是实时定量检测寄生虫体基因核酸，具有比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更独到的优势；其缺点是对实验仪器与实验室条件要求较高，成本较贵，在兽医基层包虫病防治过程中推广较难。

4　研究展望

在世界范围内，包虫病仍是引起家畜发病和死亡的重要原因之一。目前，分子生物学和免疫学检测技术的发展，尤其是ELISA方法以及PCR方法的不断改进，为包虫病诊断新技术的建立提供了机遇，也促使包虫病患畜的早期诊断与发现有了重大突破。但是现有的包虫病诊断技术中，病原的分离培养十分繁琐和困难，血清学诊断存在较多的假阳性现象，抑制差减杂交操作过程繁琐、时间长、要求高。近年来发展起来的环介导等温核酸扩增技术、免疫PCR技术以及实时荧光定量PCR等检测技术具有简单、快速、特异性强等优点，若能将这些技术应用到包虫病的诊断上，将会对该病的诊断和控制发挥重要的作用。鉴于包虫病的生活史和流行范围以及宿主众多，彻底消除该病的传播还很困难，应使用适合的方法及时准确地进行检测，从而为包虫病的预防和控制提供依据。所以加强检测与监测、定期驱虫、控制传染源、阻断流行环节，对控制与减少地方性包虫病的流行具有非常重要的作用。

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Research Progress in the Epidemiological Characteristics and Diagnosis Technology of Hydatidosis

Sun Yu，WangXiaoying，SongXiaohui，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

Hydatidosis is a serious zoonosis，which is parasitic on animals such as dogs，wolf and fox in the small intestine. Diagnosis methods ofhydatidosis include clinical symptoms，while a final diagnosis is depended on laboratorydiagnostic methods，such as serological diagnosis，imaging diagnosis，and molecular biological diagnosis.In order to provide some reference for the clinical rapid diagnosis and deep research of hydatidosis，the epidemiological features of hydatidosis，structure and life history of echinococcus，the laboratory tests and diagnostic technology of hydatidosis were reviewed in this paper.In addition，the prospects for the diagnosis ofhydatidosis in laboratorywere discussed at the end ofthe article.

hydatidosis；epidemiology；laboratorydiagnosis

S852.7

A

2095-3887（2016）01-0049-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.014

2015-10-12

农业部动物疫病监测与防治项目

孙雨，男，兽医师，博士，主要从事人畜共患病预防控制研究。

宋晓晖，女，高级兽医师，博士，主要从事草食动物疫病预防控制研究。