航天搭载对油葵的诱变效应

焦展++安胜军++王崑声等

摘要：为研究航天搭载对油葵的诱变效应，利用“神舟八号”飞船搭载油葵种子，返回地面后进行种植，并观测种子出苗状况和SP1、SP2、SP3代植株生长特性及结实种子百粒质量的变化。结果表明：航天搭载对油葵种子的发芽状况没有明显影响；通过航天搭载可增加油葵变异幅度，扩大选择范围；诱变效应在航天搭载当代即有所体现，SP2代变异表现较为明显且出现新的变异，至SP3代多数变异性状能够保持；经过航天搭载可获得株高变化、叶片大小变化、叶片叶绿素含量变化、花盘变大、花期延长、提早开花、种子百粒质量显著增高等特征的变异。由此可以看出，航天搭载的油葵对已转化的外源基因至少能够保持至SP3代，经过航天搭载获得的油葵观赏性状的变异也成为观赏向日葵研究不可或缺的宝贵资源。

关键词：油葵；诱变效应；航天搭载；生物学性状；SP1代；SP2代；SP3代；观赏性状；变异

中图分类号： S565.503文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0128-09

收稿日期：2015-03-30

基金项目：河北省科技支撑计划（编号：09276418D-1）。

作者简介：焦展（1982—），女，河北赵县人，硕士，讲师，研究方向为植物组织培养和转基因及栽培。E-mail：jiaozhan959@aliyun.com。

通信作者：安胜军，博士，教授，研究方向为植物生物反应器构建和蛋白类药物开发。E-mail：anshjun@yahoo.com。向日葵（Helianthus annuus L.）是菊科向日葵属植物，油葵即油用向日葵，是我国四大油料作物之一，同时也可作为观赏植物。农学和生物学工作者在向日葵的新品种选育、遗传转化研究、高产栽培技术等方面已开展大量工作，并且选育出一系列优良高产的新品种[1-4]。航天育种由于具有有利变异多、育种周期短等优势，近年来已被广泛关注，并取得了令人瞩目的研究成果[5-11]。目前，利用空间诱变向日葵已有部分研究。2006年，汤泽生等利用卫星搭载向日葵种子，成功获得SP2代花部变异株[12]；随后，陈卫英等对航天诱变向日葵花部形态特征、传粉生态学以及突变株系的盛花期光合效应进行研究[13-14]；沈顺等对航天诱变SP7代向日葵顶芽突变系进行性状考察，为向日葵新品种选育提供良好材料[15]；此外，Yang等利用SSR标记对向日葵航天诱变材料进行遗传背景分析，为形态变异提供分子生物学证据[16]。但油葵的航天诱变效应研究还未见报道。本试验对2011年神舟八号飞船航天搭载的油葵种子和后代植株进行有关生物学方面的观察与研究，并对航天搭载对油葵的诱变效应进行初步探讨，以期为油葵航天育种和转基因研究提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验中用于航天搭载的油葵种子均为罗马尼亚精选油葵种子恢复系，由河北省半干旱研究中心提供。用于航天搭载的油葵种子分为5组，分别编号为H1、H2、H3、H4、H14，以相应未经航天搭载处理的种子为对照，分别编号为CK1、CK2、CK3、CK4、CK14。其中，H1、CK1为油葵转胰岛素基因阳性后代T3代种子；H2、CK2同为油葵转胰岛素基因阳性后代T5代种子；H3、CK3为转胰岛素基因T2代种子；H4、CK4为油葵转阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因T2代种子；H14、CK14为非转基因种子。转基因油葵种子由河北省高校生物反应器与蛋白类药物开发应用技术研发中心提供。H3、CK3为通过去1张子叶转化并结合嫁接方法获得的转基因种子，其余转基因种子为花粉管通道方法获得。

1.2研究方法

1.2.1种子航天搭载过程用于航天搭载的油葵种子于2011年10月2日装入“神舟八号”飞船返回舱。“神舟八号”飞船于2011年11月1日5点58分由火箭发射升空，经过397 h的轨道运行，返回舱（携带供试种子）于2011年11月17日19点32分返回地面，11月21日开仓取出种子。

1.2.2航天搭载种子的播种和繁育航天搭载油葵种子（H1、H2、H3、H4、H14）与对照种子（CK1、CK2、CK3、CK4、CK14）于2012年4月29日在温室苗床单粒播种进行育苗，共播种311粒，2012年5月12日移栽至大田，定植株行距为45 cm×45 cm，为SP1代植株，每个组设对照60株。SP1代变异单株所结种子单独收获，没有变异的种子组内混合收获。SP1代植株上收获的种子于2012年11月15日在海南三亚播种，进行SP2代植株的种植。 SP2代植株包括SP1变异的单株后代（每个变异单株后代播种20株）+SP1不变异的单株群体（每个组播种150株），SP2代确保包含SP1留下的所有单株后代且群体不少于1 000株，每个组设对照60株。重点观察变异株系，根据育种目标定向选择。2013年4月29日，将海南省收获的种子播种于河北邯郸鸡泽，为SP3代植株，包括SP2保留变异性状的单株后代（每单株后代播种25株）+SP2不变异的单株群体（每组播种150株），总种植数不少于 4 000 株，每组设对照100株。对SP3代植株种植和筛选，并对生长特性进行观察记录。

1.2.3田间调查指标每株挂牌、套袋，人工自花授粉，并进行田间调查，单株收获，进行统计分析。田间调查内容包括出苗率、出苗时间、开花起止时间、花期株高、叶片长宽、叶片叶绿素含量、花期花盘直径以及结实种子百粒质量等。对航天诱变材料SP1代主要性状的变化与对照进行对比分析，比较其平均值、变异幅度和变异系数[变异系数 CV =（标准差/平均值）×100%]的差异，并对性状平均值进行差异显著性检验。性状在“对照平均数±2倍标准差”范围以外的植株当作突变株，并结合育种目标优选有益变异单株。此外，统计每代植株各测量指标的平均值、变异频率（总变异频率=每代变异总数/同代种植群体总数×100%，某品种变异频率=某品种每代变异数/该品种同代种植总数×100%）[17]。叶绿素测量方法采用丙酮乙醇混合液法[18]。

1.2.4转基因材料的阳性率统计从航天搭载材料和对照的SP1～SP3代中，每个品种每代随机选择3个株系（SP1代至少检测20株，SP2～SP3代每代至少检测60株）对植株进行目的基因的PCR检测。统计阳性率，阳性率=PCR呈阳性植株数/该株系当代统计植株总数×100%。胰岛素基因PCR引物序列：上游引物为5′-CGGGGTACCTCGTCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′，下游引物为5′-CGAGCTCTTAGTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。阿朴脂蛋白A-I米兰突变体基因引物序列：上游引物为5′-CGCGGATCCTGGTCCCAAGGGGTAGC GATGAACCACCGCAGT-3′，下游引物为5′-CGAGCTCTTATTGTGTGTTAAGTTTCTTTG-3′。

1.2.5数据统计分析数据处理用Excel 2003和DPS 7.05软件进行分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1航天搭载油葵种子的出苗期和出苗率

经过航天搭载，供试的5个品种在播种5 d后可正常出苗，1周后出苗数达到顶峰，10 d后不再有新的幼苗萌出。各处理与对照出苗期没有明显差异，均在5～7 d完成。在出苗率方面，各材料的出苗率均可达70%左右。试验中也发现个别植株虽发芽，但是芽体不正常弯曲，或者没有生长点，然而这只是个别现象。由航天搭载当代油葵种子的出苗情况可以看出，各处理与对照之间的出苗率均没有明显差异，由此可见航天搭载油葵种子对其生活力、出苗速度和出苗率均无明显的影响（表1）。

2.2航天搭载对油葵SP1代生长期主要性状的影响

由表2可以看出，从株高、叶片长宽、花盘直径和开花持续时间等生长期主要性状考察，航天搭载的5组材料的平均值与对照并没有明显差异。但是从变异范围和变异系数来看，航天搭载对各组材料的诱变效应程度各不相同。从株高来看，H1、H3的诱变效应不明显，H2的变异范围变宽，从53～74 cm变为44～91 cm。H4、H14的标准差、变异系数均大幅度高于对照，变异范围也变大。此外，株高在矮化、增高2个方向均有变化。各组航天搭载的材料叶片长宽的数值变化范围较小，只有H4、H14的标准差、变异系数比对照大幅度增加，H4的变异范围略有增大，H14主要为负向变异，航天处理最大值与对照最大值差异很小，但航天处理最小值（长1916 cm、宽16.50 cm）与对照最小值（长24.17 cm、宽 20.83 cm）差异较大。在花盘直径方面，H2、H4的标准差、变异系数和变异范围与对照相比相差较大，而其他几组数据处理和对照间各指标的差值较小。经航天搭载，H1、H4 植株的开花持续时间变化范围较对照大幅度变宽，且为正向变化，即航天搭载能够诱导油葵表现花期延长的变异趋势。

经过航天搭载，在供试的几个处理中，H4生长期各主要性状与对照相比均有不同程度的变化，在本试验中SP1代对航天诱变较敏感。H1的花期变异范围增大，并且是正向变异（花期延长），H2的株高、花盘直径的变异范围增大，H14的株高、叶片长宽变异范围增大， 而H3对航天搭载的诱变效应表2航天搭载对油葵SP1代生长期主要性状的诱变效应表现不敏感。说明航天搭载对SP1代生长期主要性状有一定影响，会扩大某些性状的变异范围，但不同性状在各材料上的表现不尽相同。

试验尽可能完整地保全了各种变异类型，选择并标记了在整个生育期中与对照表现差异的单株，SP1代植株中以超过标准差2 倍为依据确定的变异株，共13株（表3）。H1-4植株花期明显延长；H2中获得变异单株7株，其中株高变异的有6株，叶片长宽变大的1株，花盘直径变大的3株；H4-1株高明显增高，花盘变大，H4-4、H4-5花期明显延长；H14-2株叶片长宽变大，此外H14-4植株矮化，并且叶片长宽明显变小；而H3中没有发现与对照有明显差异的单株。试验表明，空间搭载条件诱发了油葵多种生长期性状变异，其中一些变异在处理当代即表现出来。

2.3航天搭载油葵SP2、SP3代突变性状的表现

SP1代筛选出的突变植株收获后播种形成SP2代群体，每个突变株系播种20株，其余为变异植株，每组播种约150株，SP2代群体不少于1 000株。由表3、表4可知，部分SP1代显现的突变性状在SP2代能够保持，但是部分突变性状不再表现（如H2-1、H2-12、H2-16的平均株高与对照并没有明显差异）。SP2代新表现一些突变性状，如H1-1-1的花盘直径变大和开花持续时间延长、H2-3-1植株叶片变大、H2-9-1的株高减小而叶片长宽增大、H2-30-1的花盘直径变大、H3-1-1的开花持续时间延长、H4-6-1的株高变大等。此外，在SP2代H1-4-X等突变株系的始花时间较对照提前2 d。这说明航天搭载油葵在SP1代仅有少数突变性状表现，而突变性状在SP2代会较明显地显现。由表5可知，SP2代表现与对照差异显著的性状在SP3代多数能够保持（如H1-1、H2-14、H4-5、H14-2突变株系），其均值明显大于相应对照。但是，这些突变性状在以后世代是否能够遗传，且这些性状的变异到底是环境因素引起还是可稳定遗传的变异，尚须要进一步深入研究，并提供分子生物学证据。

2.4航天搭载油葵SP3代植株叶片叶绿素含量变异情况

经过测定，航天搭载SP3代变异植株H2-8、H2-14、H2-31、H4-5的叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量均显著高于相应对照，而其他航天搭载SP3代植株与对照没有显著性差异（温室中种植）。在大田试验中发现，这4个变异株系的叶片叶绿素含量均高于相应对照，并且H4-4株系的叶绿素含量也高于对照，见图1至图4。

2.5航天搭载油葵SP1至SP3代结实种子百粒质量的变化

与生长期主要性状指标明显不同的是，经过航天搭载，供试材料在航天搭载当代即表现出结实平均百粒质量与对照存在不同程度的差异（图5）。其中，H1平均百粒质量为 5.98 g， 比对照高1.04 g，而其他SP1代品种与对照的差异并

不显著。经过海南省第2代种植，其结实情况如下：H1保持了种子平均百粒质量高于对照的特点，SP2代植株结出的种子百粒质量达7.11 g；而H2也在此代表现出平均百粒质量（5.86 g）显著高于对照（4.98 g），差值达0.88 g。邯郸鸡泽的SP3代结实数据同样显示H1、H2种子平均百粒质量较对照明显增加。由此可见，航天搭载能够引起某些品种种子平均百粒质量的变化，且能够保持至SP3代。

试验跟踪调查至SP3代植株所结种子，H1-1、H2-8、H2-14、H4-5、H14-2株系的种子百粒质量均明显高于本处理平均值、对照平均值，有望从中筛选出种子百粒质量增多的突变株系（表6）。

2.6航天搭载油葵SP1至SP3代转基因材料的遗传

从航天搭载材料和对照的SP1至SP3代中，每代随机选择3个株系（SP1代约20株，SP2、SP2、SP3代每代约60株）对植株进行目的基因的PCR检测。图6为4个品系与对照3代中阳性植株比率的平均值。对于航天搭载材料，在SP1至SP3代中均检测到一定比率（约为80%）的阳性植株，且同一品系的3代阳性率变化很小，说明对于已转化的外源基因，航天搭载材料至少能够保持至SP3代。

2.7航天搭载油葵SP1及后代观赏性状的观察

经过航天搭载的油葵种子大部分可正常发芽，生长速度也和未搭载的没有显著性差异。但是在SP1代植株中，H2组中有2株发现和普通植株外观有明显差异。变异株的特点是：舌状花变少，花盘内部呈不同程度的突起，部分管状花退化，退化处花盘呈淡黄色硬实状。在该变异株系的SP2代植株中，同样发现有此种变化的植株，花盘突起部分变大，且对称，十字分布，花盘外部苞叶数目变多，较正常株多2～3倍。植株茎呈多棱状，且棱数为15～20棱，与普通植株的圆柱形明显不同。茎上叶片数明显增多，轮生，呈多轮排列。跟踪观察同株系SP3代植株，发现2株完全变异株。变异株的花盘完全变为4块突起，十字对称分布，没有管状花部分。花盘苞叶数目和茎的棱数比SP2代植株更多，叶片多轮，整体植株呈莲花状（图7）。由于没有可结实部分，该变异株没有留下下一代种子。但是SP2代所结种子播种后仍有剩余，可针对同代的变异性状进行进一步研究。

2.8航天搭载对油葵诱变效应的特点

经过航天搭载，SP1至SP3代植株与对照相比表现出不同程度的生物学性状差异。经过航天搭载的5组种子，其SP1代种子发芽情况、幼苗生长情况均表现良好；与对照相比，航天诱变植株株高、叶片大小发生变化，生长健壮，开花期花盘较大，结实情况良好（图8、图9）。与同代对照相比，航天搭载SP2代、SP3代个别株系开花时间提前，花盘较大，花期延长，种子百粒质量明显增加等（图10、图11）。此外，还发现莲花状变异植株。在整个试验中，供试的311粒种子中仅发现2粒种子萌发和生长出现畸形情况。由此可见，航天搭载油葵种子使油葵朝着有利农艺性状的方向变异较多。

统计SP1至SP3代植株变异率，并作折线图（图12）。结果表明，SP1代总变异频率为4.82%。5个组对航天搭载的

敏感性不同，其中H4突变率较高为8.33%，而H3在航天搭载当代没有发现变异植株。H3的SP2代、SP3 代变异频率较

其他组明显偏小。经航天搭载的油葵材料的变异性状在SP1代即开始显现，SP2代出现较多的新的变异性状，且多数变异性状在SP3代会继续保持。自SP1至SP3代，随着代数的增加，变异株数逐渐增多，而且变异频率也逐代增高。综上所述，就本试验范围内，无论从供试材料的总变异频率，还是单独计算各组的变异率，变异植株占当代群体的比率呈自SP1至SP3逐代增高的趋势，变异性状逐渐显现。

3结论与讨论

3.1航天搭载对油葵种子发芽状况的影响

本试验结果证明，经过航天搭载的油葵种子出苗率和出苗状况没有受到影响。这和以往关于空间育种对种子萌芽影响的报道结果不尽相同[19-22]。试验中然也发现个别植株虽发芽，但是芽体不正常弯曲，或者没有生长点，然而这只是个别现象，各个品种的平均出芽率、出芽时间与对照都没有显著性差异，这说明航天搭载对油葵种子发芽状况影响不大。这可能与油葵种仁外面不仅有种皮，还有较厚果皮包被，使得其发芽状况对复杂空间诱变条件不敏感有关。

3.2航天搭载对油葵生物学性状的影响

本试验结果表明，种子经航空诱变后SP1代各指标的平均值与对照差异不显著，但是航天搭载对SP1代生长期主要性状有一定影响，会扩大某些性状的变异范围，增强选种效果，利于优良品种的选育，这与乔晓等的研究结果[23-24]一致。本研究中航天搭载后SP1代即有变异性状显现，在SP2代中表现更丰富，在前人研究中也有类似结论[22，25-26]。航天搭载会获得一些性状变异，但是不同材料甚至相同材料的不同植株对航天搭载诱变的敏感性不同，不同性状在各材料上的表现也不同，这与前人的观点[9，20，23]一致。本试验也发现，H2-14的3代植株株高、叶片长宽显著高于对照，SP1代结实种子百粒质量也较高，达6.14 g。SP2代和SP3代植株同样保留了该有利性状，株系结实种子平均百粒质量分别比对照高1.62、1.70 g。可见，经过航天搭载后，部分营养生长较为强壮的株系结实情况也明显优于其他株系，且所产生的植株变高、叶片变大、百粒质量提高等变异在SP2至SP3代是可以保持的。而H2-8株系SP1代植株营养生长方面没有表现优势，花盘直径显著大于对照，其结实百粒质量明显增大，为6.60 g；SP2代和SP3代植株开花期提前和结实期花盘直径明显大于对照，2代结实百粒质量也较对照明显增高。因此，航天搭载对植株营养生长和生殖生长的影响是复杂的。营养生长方面的适度变异能够促进生殖生长，使种子百粒质量增加。而经过航天搭载的植株后代结实种子百粒质量增加可能与多种因素有关，如花期长短、花盘大小等，以及栽培环境等外界因素。

航天搭载油葵种子确实能够引起植株株高、叶片长宽、花盘直径、花期、种子百粒质量等一系列变化。可能是因为油葵种子在太空强辐射、高真空、地球磁场和微重力等因素的作用下，影响其体内的生理生化反应、细胞分裂、细胞间信息传递、光合呼吸作用以及生长发育等进程，从而产生植物形态和生理代谢的变化，或者可能使油葵控制营养生长、花盘直径、花期或结实的某一基因产生突变[27-28]。但是，这些改变完全是由航天搭载诱发的，或者航天搭载只是诱发其中少数指标的变异少数变异与植株生长环境等因素相互作用间接导致其他指标的变异还有待进一步深入探讨。

3.3航天搭载对油葵的诱变效应

试验结果证明，经过航天搭载，油葵的性状变异不仅在航天搭载当代有所体现，在SP2代变异株系中表现更明显，而且多数变异能够保持至SP3代。此外，本试验所得到的丰富变异材料扩大了油葵育种选择范围，得到了一系列如株高变化、叶片变化、花期延长、始花期提前、百粒质量增高等变异，由此推测这些变异在后代繁育中能够使油葵表现更广泛的适应性和更强大的生活力，从而有望选育出优异的品种类型。但是本研究只从形态方面对航天诱变油葵的变异进行对比分析，不能确定其变异是由环境因素引起的，还是由遗传物质引起的。因此，要确定其变异能够遗传以及遗传的稳定性，还须利用分子生物学手段进一步明确航天搭载材料遗传物质变异的真实性和变异机理。然后，还应对有明显变异的个体进行突变性状遗传规律进行研究，并进行考种和异地试验等，从而对航天搭载油葵的变异材料加以利用，以期获得油葵新的种质资源。

3.4航天搭载对油葵观赏性状的影响

观赏向日葵研究已成为观赏园艺研究热点之一。本试验发现，经过航天搭载，有些株系出现花期延长、提早开花的现象，而且这些变化至少能够保持到SP3代。可将此特点应用至观赏向日葵的研究中，为培育观赏向日葵新品种提供思路。此外，还发现叶片增多、莲花状花盘变异株系，该变异株系SP3代有2株植株整体酷似莲花。但是，由于结实部分变异，导致结实困难，没有留下下一代种子。但该株系SP2代植株所结种子仍有剩余。可将剩余种子播种，从中继续选择变异株，并通过组培技术手段保留变异种质，从而为观赏花卉方面的研究提供新的材料。

本试验对航天搭载油葵SP1至SP3代生物学性状进行系统观察和初步研究，结果显示，航天搭载对油葵种子及后代植株有诱变作用，航天搭载油葵种子可获得株高叶片变化、花期长、早熟、种子百粒质量提高等多种变异，从而为进一步选育油葵新的优良品种提供材料。但对于航天搭载对油葵变异的真实性和机理还须进一步探讨，今后的研究可结合生理指标的测定以及分子生物学手段对变异株系进行系统探讨，从而得到航天育种新种质。航天搭载的油葵对已转化的外源基因至少能够保持至SP3代，但航天搭载是否会影响外源基因的遗传效率以及外源蛋白的表达效率有待进一步研究。此外，经过航天搭载获得的油葵观赏性状的变异也成为观赏向日葵研究不可或缺的宝贵资源。

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