中华蜜蜂OBP17基因CDS序列及其表达与抗螨性状的相关性

殷玲　吉挺　李冠华等

摘要：OBP17是蜜蜂气味结合蛋白质（odorant binding proteins，OBPs）家族中的成员，参与气味分子的识别，对嗅觉起重要作用。蜜蜂的抗螨性状与嗅觉密切相关，为研究蜜蜂OBP17基因的功能及其与抗螨性状的相关性，以中华蜜蜂头部组织cDNA为模板，PCR扩增OBP17基因完整CDS序列，利用生物信息学方法分析CDS序列及其编码的氨基酸序列，利用RT-PCR方法检测OBP17基因在不同抗螨性状的中华蜜蜂头部组织中的相对表达量。结果表明，OBP17基因CDS全长为408 bp，编码135个氨基酸的分泌性蛋白，无跨膜螺旋，是比较保守的基因；RT-PCR检测结果显示，在蜂螨胁迫下的中华蜜蜂头部组织中，OBP17基因的表达量显著高于未受胁迫的抗性群体及受到同等蜂螨胁迫的敏感性群体。中华蜜蜂OBP17基因的表达变化与蜂螨感染过程相关，说明OBP17基因在中华蜜蜂的抗螨行为中起重要作用。

关键词：中华蜜蜂；OBP17；克隆；生物信息学；狄斯瓦螨

中图分类号： S895.3+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0045-04

收稿日期：2015-01-22

基金项目：国家自然科学基金（编号：31372382）；江苏农牧科技职业技术学院重点科研课题（编号：NSFRC1401）。

作者简介：殷玲（1983—），女，江苏泰兴人，博士，讲师，主要从事蜜蜂分子生物学研究。E-mail：lingyin_txx@163.com。昆虫通过嗅觉受体神经元的调节来识别并区分成千上万种气味复合物，而气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）家族则承担特异性识别、转运气味复合物至受体的运输功能[1]，因此气味结合蛋白与昆虫的嗅觉敏感性密切相关。目前，国内外关于蜜蜂OBPs家族的基因功能研究较少，关于中华蜜蜂OBPs家族的研究更少。李红亮等对ASP2进行CDs的克隆，并对其功能模式进行分析[2-3]；张小辉等克隆了中华蜜蜂气味结合蛋白5、9、11、12的完整基因序列[4]；陈扬等对中华蜜蜂头部CSP3基因的CDS序列进行分析[5]。OBP17是蜜蜂气味结合蛋白质家族中的成员，是低分子量水溶性酸性蛋白质，有6个保守的半胱氨酸位点，在西方蜜蜂的身体各部位均有表达[6]，但其具体功能却不得而知。

狄斯瓦螨（Varroa destructor）别称大蜂螨，是对世界养蜂业威胁最大的蜜蜂病虫害，对西方蜜蜂产业造成了巨大损失[7]，也是我国最重要、必须严加防范的蜜蜂寄生虫害[8]。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是东方蜜蜂的地理品种，生活于我国境内，狄斯瓦螨对其并不造成伤害[9]。周婷对我国主要中蜂饲养区的大蜂螨寄生状态进行了调查，发现中蜂群中螨的寄生率极低，有些地区的中蜂群中甚至难以找到狄斯瓦螨的踪迹，但也有极少数群体出现与西方蜜蜂感染蜂螨相同的症状，如花子、残翅等[10]。很多研究表明，嗅觉敏感性强的蜜蜂可以迅速察觉并区分正常与不正常幼虫的气味，其清洁行为更易被激发[11-12]。蜜蜂嗅觉敏感性的差异可导致其清洁及梳理行为的差异，从而导致抗螨性状的差异[13]；虽然这一机理被广泛接受，但其分子机制却不清晰。

本研究以中华蜜蜂头部组织cDNA为模板，PCR扩增OBP17基因完整CDS序列，利用生物信息学方法分析CDS序列及其编码的氨基酸序列，并在蜂螨胁迫及没有蜂螨胁迫的条件下，利用RT-PCR方法检测OBP17基因在不同抗螨性状的中华蜜蜂头部组织中的相对表达量，以期为蜜蜂OBP17基因的功能及其与抗螨性状相关性的研究提供参考。

1材料与方法

1.1试验蜂群及蜂螨胁迫

本试验选用广东昆虫研究所实验蜂场内具有蜂螨抗性、蜂螨敏感性的中华蜜蜂群体各2群。将2张狄斯瓦螨感染程度相当的巢脾分别放入蜂螨抗性中华蜜蜂、蜂螨易感性中华蜜蜂的蜂箱内，对照组放入无蜂螨感染的西方蜜蜂巢脾，胁迫24 h后进行样本采集，4个蜂群各采集150只哺育蜂（18日龄以内）。

1.2总RNA的提取、检测、反转录

采用Trizol法提取中华蜜蜂头部组织的总RNA。以总RNA为模板，使用First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司产品）并参照说明书进行反转录，合成cDNA第1链。

1.3CDs的克隆测序

1.4序列分析

利用BLAST软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析序列的同源性；利用clustalw软件（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html）分析OBP17基因与近源物种相同基因的差异；利用ExPASy网站的ProtScale程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析蛋白疏水性结构；对蛋白质跨膜结构进行预测（http：//www.ch.embnet.org/sortware/TMPRED-form.html），并对信号肽区域进行分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalP/）；利用在线工具（http：//www.ch.embnet.org/software/COILs-form.html/）进行跨膜螺旋预测；利用PSIPRED v3.0软件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）预测目的蛋白的二级结构。

1.5实时定量PCR引物设计及目的片段扩增

根据获得的OBP17基因CDs序列及β-actin（登录号：AB023025）外显子序列，利用Premier primer 5.0软件设计引物（表1）。

2结果与分析

2.1东方蜜蜂OBP17基因克隆及序列分析

PCR扩增OBP17基因目的条带（466 bp），经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在400～500 bp之间可见1条清晰的特异性条带（图1）。测序结果显示，其长度为466 bp，包含完整的CDS序列408 bp，编码135个氨基酸，序列已提交至Genbank（登陆号KM591216.1）。

利用clustal x软件将中华蜜蜂与其他昆虫类的OBP17基因氨基酸序列进行相似度比较（图2），与西方蜜蜂（A. mellifera，NP_001035297.1）的相似度高达100.00%， 其

余依次为金小蜂（Nasonia vitripennis，CCD17786.1）21.74%、棉铃虫（Helicoverpa armigera，AFI57166.1）20.59%、烟夜蛾（Helicoverpa assulta，AGC92792.1）20.59%、拟谷盗（Tribolium castaneum，EFA02861.1）13.42%、刺舌蝇（Glossina morsitans morsitans，EFA02861.1）11.10%。

2.2东方蜜蜂OBP17基因氨基酸的理化性质

利用ExPASy服务器分析中华蜜蜂OBP17基因蛋白的理化性质，其共有135个氨基酸，分子式为C656H1078N168O210S11、分子量15 031.4、理论等电点4.54、估计半衰期30 h、不稳定

指数28.71（为稳定蛋白）、脂肪指数111.19、亲水指数 0.146。使用ProtScal程序在线分析东方蜜蜂OBP17基因的疏水性（图3），疏水性指数的最大值、最小值分别为3.322、-2.256，由此推测中华蜜蜂OBP17基因蛋白为疏水性蛋白。使用PSIPRED v3.0程序分析东方蜜蜂OBP17基因蛋白的二级结构，预测结果表明OBP17基因没有β-折叠，属于全α型蛋白。

2.3东方蜜蜂OBP17基因的蛋白序列信号肽及蛋白质跨膜区域预测

使用SignalP-4.1程序[15]在线分析东方蜜蜂OBP17基因的信号肽，结果（图4）显示，东方蜜蜂OBP17基因具有信号肽，最可能的剪切位点预测在第16位点至第17位点间，成熟蛋白启动的位置为17，预测信号肽的长度为第1位点至第16位点氨基酸。使用TMHMM service 2.0程序在线分析东方蜜蜂OBP17基因的跨膜区，并未发现OBP17基因具有跨膜区。

2.4OBP17基因在不同抗螨性能蜂群中的表达

对蜂螨胁迫处理组、蜂螨抗性对照组、蜂螨敏感性对照组的中华蜜蜂头部组织中OBP17基因的表达水平进行比较分析。蜂螨抗性对照组的样品命名为C，受蜂螨胁迫24 h的样品命名为C+；蜂螨易感对照组的样品命名为M，受蜂螨胁迫

24 h的样品命名为M+。结果（图5）表明，在蜂螨胁迫下的抗性群体头部组织中，OBP17基因的表达量显著高于未受胁迫的抗性群体和受同等蜂螨胁迫的敏感性群体，可见中华蜜蜂OBP17基因的表达变化与蜂螨感染过程相关，说明OBP17基因可能在中华蜜蜂的抗螨行为中起重要作用。

3结论与讨论

本试验以中华蜜蜂头部组织为材料，克隆出OBP17基因完整CDS序列，采用生物信息学方法对序列及其编码的蛋白质进行分析和预测。结果表明，OBP17基因CDS序列全长为408 bp，编码135个氨基酸；将该基因CDS区与GenBank中其他昆虫纲的同源基因进行比对，发现其与西方蜜蜂（NP_001035297.1）的同源性高达100%，充分体现了2个物种的近缘关系，同时表明气味结合蛋白在这2个物种间高度保守，其功能很可能相似。对OBP17基因蛋白氨基酸序列进行分析和功能预测，显示其为分泌性疏水蛋白，无跨膜结构，这与气味结合蛋白转运气味分子的功能相符合，并证明试验所克隆序列的正确性。

嗅觉敏感性差异是导致蜜蜂抗螨性状差异的重要原因[16-18]，而气味结合蛋白OBPs对蜜蜂感受外界气味起重要作用。OBPs与脂溶性气味分子发生的作用，是昆虫专一性识别外界气味物质所发生的第1步生化反应[6]。经RT-PCR分析发现，OBP17基因在蜂螨胁迫下的抗性东方蜜蜂中高度表达，而在未受蜂螨胁迫的抗性群体及敏感性群体中表达量很低，可见OBP17基因在中华蜜蜂的抗螨过程中起重要作用。目前，梳理行为、卫生行为是最普遍接受的蜜蜂抗螨机制。很多研究表明，具有抗螨性状的蜜蜂能够发现、抓住、撕咬正在移动的蜂螨，梳理自己和同伴身上的蜂螨，还可检查房内已被病害感染的蜜蜂幼虫，咬开封盖房并清除感染幼虫[9，19-20]。蜂箱内为暗环境，蜜蜂很可能通过有效识别蜂螨的特殊气味（螨害体表表皮碳氢化合物）而将其清除[21]。由此推测，蜂螨抗性群体、敏感性群体对蜂螨气味的敏感度差异造成了其蜂螨抗性的差异，而OBP17基因可能在此过程中起重要作用。本试验的推测尚须进一步研究加以论证。

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