Smad-4在结直肠癌的表达及评价患者预后的研究①

王星权，王亚洲，陈玉强，王跃生，吕　鑫

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)



Smad-4在结直肠癌的表达及评价患者预后的研究①

王星权，王亚洲，陈玉强，王跃生，吕鑫

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的: 借助免疫组化方法检测结直肠癌及癌旁组织中Smad-4的表达情况，评估Smad-4作为结直肠癌患者预后评估指标的可能性。方法:采用免疫组化法检测97例结直肠癌组织及37例癌旁组织中Smad-4的表达情况，结合患者的临床随访资料数据回顾性分析患者肿瘤标本中Smad-4的表达量与患者术后总体无瘤生存两者之间的关系。结果:一定比例的(63例)结直肠癌肿瘤组织中可见Smad-4蛋白的显著表达，其阳性表达率为64.94% [63/97]，高于癌旁、正常结直肠黏膜细胞，在结直肠癌旁组织中的阳性表达率为(6例)16.21%[6/37]，两者比较，差异具有显著的统计学意义(P<0.05)；而且证实Smad-4蛋白表达高、低两组患者的术后生存情况有显著差异(P<0.05)。结论：Smad-4蛋白在结直肠癌患者组织中存在高表达，在患者肿瘤组织中存在Smad-4高表和低表达的两类患者中，其临床预后存在显著的统计学差异。Smad-4蛋白可以有条件的作为评估术后结直肠癌患者临床预后的蛋白标记物。

关键词：Smad-4；结肠癌；免疫组化

近些年来，结直肠癌在我国的发病率逐年增高，结直肠癌一直是我国消化系肿瘤研究领域的重点关注项目，是最常见的恶性肿瘤之一[1]。2008年，全球有超过120万的结直肠癌新发病例，其死亡率约占全部恶性肿瘤的8%[2]其是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,其浸润和转移程度是影响预后的主要因素[3]。Smad-4蛋白的基因定位于常染色体18q21，其所编码的Smad-4蛋白是TGF-β1 信号转导通路发挥功能时所涉及的必须的介导分子蛋白，对维持机体细胞正常的生长、发育起着重要的作用，两者数量、结构、功能上的稳定性是TGF-β1 在细胞内外不同环境下发挥多种生理、病理功能并产生各种生物学效应的关键，这其中涉及到肿瘤的发生、发展病理生理过程[4]。多项研究均证实Smad蛋白家族和肿瘤的关系十分密切，在很多实体瘤和非实体肿瘤中都有明确表达和病理学意义[5,6]。 本课题拟通过考察Smad-4在结直肠癌中的表达情况同时整合结直肠癌患者的术后随访资料，同时考查其在评价结直肠癌患者临床预后方面的意义以及将Smad-4作为评价结直肠癌患者预后参考指标的可能性，从而对临床结直肠癌患者术后的生存预测、指导患者综合治疗方案的实施有意义。

1　材料和方法

1.1标本来源与分组

实验组：结直肠癌标本组织来源及病例选择、纳入标准选取2006-02～2008-12佳木斯大学附属第一医院住院结直肠癌根治术的患者病理标本。研究期间共查找到164例病历资料或记录明确因结直肠癌而在我院行结直肠癌根治术治疗的患者，根据纳入研究标准筛选接受结直肠癌根治术且已经获取确切随访资料的结直肠癌标本共计97例。所有患者标本均经病理证实为结直肠癌，术前未接受任何术前放、化疗及其他抗肿瘤治疗，术后患者均根据NCCN指南而采用正规肿瘤内科的化疗或放疗。所有纳入研究的患者接受的手术术式均为结直肠癌根治术。对照组：癌旁或正常的结直肠组织标本37例标本，取自结直肠癌对应的周边组织，或良性肿瘤的外围组织，病理切片HE检查证实未受癌侵润及未发生癌变。记录主要针对以下几项内容：患者已经死亡者(询问其死亡时间、死亡原因是否与结直肠癌相关)；患者仍存活(询问患者目前的生存状态、荷瘤生存、无病生存，如为肿瘤复发，荷瘤生存则记录肿瘤复发时间或发生转移的时间)；无法随访(失访)，记录失访时间；如随访期限内患者死亡，证实患者死亡原因，依据患者死亡原因是否与结直肠癌相关，若死于非结直肠癌或其他疾病、并发症，则归属失访。所有患者的随访结果依照设计的随访内容表格进行，截至实验随访结束时，所有完成随访的患者107例中有31例术后存活，生存期超过5年者计37例，占同期结直肠癌手术患者总数的34.6%；70例死亡，死于转移者30例，死于结直肠癌复发者36例，另有4例死于其他疾病。12例发生复发或转移但截至随访结束时仍存活。

1．2试剂和材料

免疫组织化学所采用的主要试剂是：山羊Smad-4多克隆抗体，；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗、免疫组化试剂盒、DAB显色剂等；另外实验采用的其他试剂详见下文列述。

1.3实验方法

所有结直肠癌组织的标本均经4%中性甲醛固定，石蜡包埋后贮存。确诊为结直肠癌后，采用两步法进行免疫组组织化学染色。对贮存时间3年内的标本采用pH8.0的EDTA修复液，贮存时间超过3年的病理标本切片采用pH6.0的柠檬酸盐抗原修复液。石蜡包埋组织切片采用免疫组织化学两步法检测结直肠癌标本中Smad-4的表达，所使用的第一抗体为山羊多克隆抗体，以已知的阳性切片作为阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗。切片染色后由两位专业副高职称的病理科医师分别盲评阅片、评定以确定切片各自的阳性结论。

1.4结果判定

1.4.1Smad-4表达的检测及评价

每张染色确定成功的切片随机选取5个有效视野，摒弃切片的边缘、组织切片的炎症坏死区、大血管经过区、切片刀痕、切片捞片过程中形成的皱折、坏死或挤压重叠区域。图像分析系统对已判定阳性切片进行判定及计算阳性肿瘤细胞的百分率：先在100倍光镜扫视整个切片，后在400倍光镜下随机取5个视野，取其平均值作为结果。

1.4.2染色判定

以每个视野下的阳性细胞计数占该视野下总体细胞百分率(点密度阳性率)以阳性细胞数低于10%记为为阴性；10%~25%计为“+”；25%~50%计为“”；50%~75%计为“”；>75%计为“”。

1.5统计学方法

采用统计软件包SPSS13.0进行，P<0.05为差异存在统计学意义。

2　结果

2.1Smad-4在结直肠癌组织中与癌旁组织内的表达

本研究发现，结直肠癌与癌旁组织Smad-4的表达染色情况经两独立样本秩和检验，其存在的差异具有统计学意义。见表1。(后续统计时以阴性“+，”纳入统计)

表1　Smad-4在结直肠癌及癌旁组织中的表达

2.2Smad-4表达与预后生存期的关系

采用Kaplan-Meier法进行的患者生存分析结果证实：Smad-4的高表达与患者的无病生存期关系密切，即结直肠癌组织中具有Smad-4高表达的患者，其术后总体生存期较低表达组患者为好，两相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1　Smad-4高表达组与低表达组患者的术后总生存情况

Kapla-Meier法生存分析:其结果显示Smad-4高表达组(蓝线)与低表达组(绿线)患者的术后总生存情况，差异性存在统计学意义(P<0.05)。

3　讨论

结直癌为胃肠道常见的恶性肿瘤之一，近年来在我国的发病率有明显的增高趋势[7]。Smad-4基因是首先在胰腺癌中发现的新型肿瘤抑制基因，其所编码的产物蛋白Smad-4是TGF-β/Smad信号转导通路中最为重要的信号转导分子，在该信号转导将外界刺激信号转导至胞核内，继而调控靶基因转录、翻译的过程中发挥着关键作用[8]。业已证实，TGF-β/Smad信号转导通路各关键蛋白的的表达下降或生化功能失活参与了肿瘤的发生、发展[9]，这点与本实验中发现的Smad-4蛋白的表达下降与结直肠癌患者术后的不良预后相关。除此传统的抑癌功能之外，研究证实Smad-4蛋白还具备一些独立于TGF-β/Smad信号转导通路之外的生化功能，参与调控细胞内其他相关基因的表达[10]。通过完成此项课题，我们发现结直肠癌组织中Smad-4的表达与患者的临床病理学指标、患者预后等存在着密切的关系。实验结果证实，Smad-4在结直肠癌中存在较高的表达率，Smad-4阳性表达的患者其生存率要高于阴性患者，其两相比较差异性具有统计学意义(P<0.05)，其总体患者的中位生存时间也是表达阴性者的近两倍，充分说明Smad-4在结直肠癌患者中具有重要的临床评估价值和意义。总体上讲，结直肠癌患者的预后评估应该将Smad-4的表达情况与该肿瘤患者的其他临床病理资料结合起来进行无疑更科学、合理、准确，建议临床上经大样本、更严格的统计学检验后推广应用。

参考文献：

[1]陈琼，刘志才，程兰平，等.2003～2007年中国结直肠癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤学杂志, 2012，21(3): 179-182

[2]Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: Globocan 2008[J]. Int J Cancer，2010，127(12):2893-917

[3] 刘成敏，张成仁，王秀梅.Smads介导的TGF-β信号通路与肿瘤关系的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2010,17(8):631-634

[4]李宁，李丽娟.结、直肠癌中PRL-3、RhoC的表达及与浸润转移的关系[J]，黑龙江医药科学，2008，31(2)：14-15

[5]Su E, Han X, Jiang G. The transforming growth factor beta 1/SMAD signaling pathway involved in human chronic myeloid leukemia[J]. Tumori，2010，96(5):659-666

[6] Matsuzaki K. Smad3 phospho isoform-mediated signaling during sporadic human colorectal carcinogenesis[J].Histol Histopathol,2006,21(6):645-662

[7] 王凯峰，衣甜甜.结肠癌血清中表皮生长因子受体的表达水平及其临床意义[J].黑龙江医药科学，2013,36(6)：15-16

[8]Padua D, Massagué. Roles of TGFbeta in metastasis[J].Cell Res，2009，19(1):89-102

[9] Miyaki M, Kuroki T. Role of Smad4 (DPC4) inactivation in human cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun，2003，306(4):799-804

[10] Shiou SR, Singh AB, Moorthy K, et al. Smad4 regulates claudin-1 expression in a transforming growth factor-beta independent manner in colon cancer cells[J]. Cancer Res，2007，67(4):1571-1579

Clinical outcomese expression of Smad-4 in colorectal cancer tissues, its
signal mechanism and its role in the evaluation of patients’ clinical outcomes

WANGXing-quan,WANGYa-zhou,CHENYu-qiang,WANGYue-sheng,LÜXin

(Clinical Medical College of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To detect colorectal cancer and paracancerous tissues Bby means of immunohistochemical Smad-4 method of detecting colorectal cancer and paracancerous tissues,so as to assesssment of the potential of Smad-4 as the prognosis of patients with colorectal cancer assessment index. Methods: Expression of Smad-4 was detected by immunohistochemistry in 97 cases of colorectal carcinoma tissues and 37 cases of para carcinoma tissues, combined with clinical fÜollow-up data of a retrospective analysis of expression of Smad-4 in tumors from patients in patients after general no relationship between survival of both. Results: Certain proportion (63 cases) was significantly expressed Smad-4 protein in colorectal cancer tissues,the positive expression rate of [63/97] was 64.94%, higher than that of adjacent normal colorectal mucosa, the positive expression in cells, tissues adjacent to colorectal cancer in the rate of (6 cases) 16.21% [6/37], (P<0.05).The comparison between the two was, different with statistical significance significant differences in the expression of Smad-4 protein and confirmed that ; high, low of the two groups of patients with postoperative survival have significant differences (P<0.05).Conclusions: Smad-4 protein has high expression in tissue of patients with colorectal cancer, there are two kinds of patients with higher Smad-4 surface and low expression in cancer tissue, there was a significant difference, the clinical prognosis. Protein marker Smad-4 protein can be used to evaluate the clinical outcome of patients with rectal cancer after operation nodes of conditional.

Key words:Smad-4;colorectal cancer;immunohistochemistry

中图分类号：R735.3+7

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2015)06-0077-02

作者简介:①王星权(1988～)男,黑龙江佳木斯人,在读硕士研究生。

通讯作者:王亚洲(1956～)男,黑龙江佳木斯人,硕士,主任医师,教授,硕士研究生导师。E—mail:sln.shm.ily@163.com。

(收稿日期：2015-03-13)