PCR反应常见问题及对策分析

王英 邓永强 张代 芬邢坤 （四川省动物疫病预防控制中心 610041）

PCR反应常见问题及对策分析

王英 邓永强 张代 芬邢坤 （四川省动物疫病预防控制中心 610041）

PCR是快速扩增DNA的一种方式，可检测到剂量非常低的DNA分子，常用于动物疫病病原的快速检测。文中对PCR反应中常见问题及原因逐一分析，以提高PCR反应的准确性，科学指导动物疫病诊断。

PCR；常见问题；对策

PCR全称聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction）， 1983 年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法[1]。PCR是体外快速扩增DNA的一种方式，主要在高温下变性、低温退火、适合温度下延伸等步骤循环进行，使DNA迅速扩增。

PCR反应特异性强、灵敏度高、简便，可快速体外检测微量DNA，是各级兽医实验室快速检测和诊断的常用技术，检测结果的准确性直接关系动物疫病的诊断和诊治效果。现将PCR反应中常见的问题及原因汇总分析如下，以提高PCR在临床诊断中准确性，科学指导动物疫病诊断。

1 假阳性

1.1 引物不合适

靶序列太短或引物太短易出现假阳性。引物特异性不强，即能扩增出目的序列，也能扩增出非目的性序列，导致假阳性。需要重新设计特异性强的引物。

1.2 气溶胶污染

空气与液体面摩擦，操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖或吸样时移液枪的反复吸样都可形成气溶胶而导致污染。操作时要轻柔，避免气溶胶的产生。

1.3 仪器污染

离心管密封不严导致反应液在操作过程中附着在离心机、PCR反应仪等仪器上，或由于移液枪使用不当，样本吸附在移液枪内壁导致交叉污染。定期清理离心机、PCR反应仪，减少交叉污染。移液枪应专用，如只用于加样或提取DNA等。

1.4 操作不规范

由于操作不当，阳性对照DNA混入检测样本中从而出现假阳性扩增。操作时应小心轻柔，防止阳性对照DNA吸入加样枪内或溅出离心管外。加样时应先加阴性对照样品，再加待检样品，最后再加阳性对照样品。

1.5 器材污染

PCR反应应用的所有器材包括枪头、离心管等均应高压消毒，离心管和枪头等应一次性使用。吸取不同样本时要及时更换枪头，必要时，反应管和试剂用紫外线照射以破坏存在的核酸。实验操作要考虑分区试验，如设立DNA提取室、扩增室等。

2 假阴性

2.1 DNA模板纯度不佳

在提取模板的过程中，操作不当导致模板丢失过多、杂蛋白质高，或制备的模板中含有PCR反应抑制剂[2]都会影响PCR的扩增效率。重新提取DNA模板。

2.2 变性不完全

变性温度低或时长不足导致模板DNA变性不彻底，最终扩增失败。提高变性温度，延长变性反应时间。

3 反应条带弱

3.1 DNA模板量太少

组织样本中DNA含量低，所以提取出的DNA浓度低，导致反应条带弱。增加DNA模板量，确保DNA模板干净。

3.2 引物量不足

引物过少导致PCR反应效率低。在PCR反应中，引物浓度一般为0.1～0.5umol/L[3]。增加引物量。

3.3 变性时间过长

变性时间过长导致DNA聚合酶失活。注意减少变性时间。

3.4 退火温度过高

退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。以2℃为梯度设计梯度优化退火温度。

3.5 延伸时间太短

碱基没有充分的时间进行配对延伸导致扩增效率低。以5s为梯度优化延伸时间。

3.6 PCR循环数不足

适当增加循环次数，提升PCR扩增效率。

4 出现非特异性扩增带

4.1 DNA模板量过多

稀释模板后重新进行PCR反应。

4.2 引物特异性不强或浓度偏高

引物与靶序列不完全互补或聚合形成二聚体导致非特异性扩增过多，浓度偏高则会引起错配和非特异性扩增[1]。重新设计特异性强的引物，同时降低引物浓度。

4.3 Tap聚合酶量过多

减少DNA聚合酶的使用量。

4.4 Mg2+离子浓度过高

M早2+浓度过高可降低PCR反应的特异性。注意降低M早2+浓度。

4.5 dNTP浓度过高

减少dNTP的使用量。

4.6 退火温度过低

提高退火温度可减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。以2℃为梯度优化退火温度。

4.7 PCR循环次数过多

减少反应循环数。

5 PCR扩增产物拖尾

5.1 模板纯度不佳

提取的模板中杂蛋白含量高而导致扩增产物有拖尾现象。重新制备纯度高的DNA模板，严格操作，减少模板中杂蛋白含量。

5.2 缓冲液不合适

缓冲液的加入有助于酶的稳定。更换缓冲液。

6 条带大小与理论值不符

6.1 模板或引物使用错误

重新配制反应体系，确保加入正确的模板和引物。

6.2 污染

环境污染、气溶胶污染和仪器污染都会影响PCR反应的特异性。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行彻底清洁后重新进行PCR反应。

7 阳性对照无条带

7.1 DNA模板量太少

增加DNA模板量，并确保DNA模板干净。

7.2 延伸温度过高

不利于引物和模板的结合。以2℃为梯度优化延伸温度。

7.3 变性温度与时间

变性温度低，样本DNA解链不完全导致PCR反应失败。提高变性温度和反应时间。

7.4 退火温度不合适

以2℃为梯度优化退火温度。

7.5 延伸时间过短

延伸反应的时间可根据扩增片段的长度而定，一般1kb以内延伸1min[1]。以5s为梯度优化延伸时间。

8 阴性对照出现条带

8.1 仪器污染

PCR反应仪、工作台、试剂和枪头有污染。使用全新的试剂，枪头要高压灭菌，对反应仪器和工作台进行彻底清洁。

8.2 气溶胶污染

空气中的气溶胶进入反应管导致阴性对照出现条带。

9 检测重复性不佳

9.1 加样不准确

加入的试剂或模板量不均一导致PCR反应结果不一致。

9.2 仪器硬件因素

更换了反应管或PCR反应仪导致PCR反应结果不一致。

[1]魏群.分子生物学实验指导.北京:高等教育出版社;海德堡:施普林格出版社,1999.12.

[2]现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版社,1993.

[3]PCR检验技术[M].四川大学出版社,1995.

文中有些资料摘自Internet网站，资料中未列出作者，在此向作者表示感谢！

王英，女，黑龙江省鸡西市人，硕士，兽医师，现从事动物疫病防控工作。