靶向survivin shRNA在肿瘤治疗中的研究进展

张　鑫　郝玉琴

·综述·

靶向survivin shRNA在肿瘤治疗中的研究进展

张鑫郝玉琴

生存素在细胞凋亡抑制中起重要作用，越来越多的研究者将其作为肿瘤基因治疗的理想靶点。应用RNA干扰技术靶向抑制生存素的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。

生存素； shRNA； 肿瘤

生存素（survivin）是凋亡抑制基因家族中分子量最小而抗凋亡作用最强的成员，在正常成人组织很少表达，而在各种恶性肿瘤中高度表达，生存素具有抑制细胞凋亡，参与细胞周期调控，促进细胞分裂增殖，促进血管增生等多种生物学功能。生存素在肿瘤组织中的特异性表达和功能，使其成为肿瘤研究的新靶点。RNA干扰技术是一项高特异性和高效率的基因沉默技术，在肿瘤相关基因的功能研究和基因治疗方面具有广阔的应用前景。

1　生存素概述

生存素是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成员之一，位于染色体17q25，全长14.7kb包含4个外显子和3个内含子，是分子量最小但抗凋亡活性最强的成员。生存素蛋白分子量很小，氨基酸末端仅包含有一个含有半胱氨酸、组氨酸的杆状病毒lAP重复（baculoviral IAP repeat，BIR）序列，其在抑制细胞的凋亡方面起重要作用［1］。生存素的表达具有特异性，主要表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织。生存素表达与IAPs家族其他成员的最大区别就是其除子宫内膜、胎盘组织和胸腺组织中存在不同程度表达外，在其他大多数组织不表达，而其余的lAPs则能够广泛表达于正常成人组织中［2］。由此可见，生存素的表达分布具有明显的组织细胞选择性，即主要表达于胚胎及未分化成熟的组织中。生存素的表达具有细胞周期依赖性，主要表现为只在细胞有丝分裂的G2/M期表达，G1期几乎不表达，在有丝分裂G2/M期，生存素可与有丝分裂纺锤体的微管特异性结合，调节细胞有丝分裂［3］。生存素在癌细胞中的过度表达可能促进其跳过细胞周期检查点通过有丝分裂而促进癌细胞分裂增殖［4］。由于生存素启动子在正常组织细胞中基本静止，而在肿瘤组织细胞中过度表达，所以其被公认为是肿瘤相关基因［5］。研究发现生存素具有抑制细胞凋亡，参与细胞周期调控，促进细胞分裂增殖，促进血管增生等多种生物学功能［6，7］。

2　RNA干扰技术作用机制及应用

2.1RNA干扰机制 当外源性基因随机整合到细胞进行转录时，常会产生一些双链RNA（double strands RNA，dsRNA）。宿主细胞胞质中的核酸内切酶（Dicer）将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段即RNA干扰相关效应分子（small interfering RNA，siRNA）。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成 RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合。具有核酸酶的功能RISC，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端，被切割后的断裂mRNA随即降解，导致了该mRNA转录的蛋白质无法合成，出现了该mRNA转录的基因不能表达的现象即基因沉默现象［8］。

2.2RNA干扰技术的应用 RNA干扰技术是先确定靶基因的结构，利用dsRNA进入细胞后特异性降解细胞内同源信使RNA（mRNA），从而阻断特定基因表达，其作用相当于基因敲除。目前RNA干扰的方法最常用的就是直接转染siRNA和构建shRNA载体。但是化学合成siRNA成本大且作用时间短，使其应用受到限制。

shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，通过载体将克隆其编码的DNA导入细胞，在细胞中，shRNA被加工成siRNA，发挥抑制特异mRNA表达的作用，这种装载了shRNA的载体可以通过筛选，稳定传递到子代细胞中去［9］。载体介导shRNA表达技术能长期和稳定地抑制靶基因的表达，因此可用来构建理想的实验细胞模型，与化学合成siRNA法相比具有更大的应用潜力，因此shRNA表达载体技术成为肿瘤基因治疗的强大工具。

3　靶向survivin-shRNA在肿瘤治疗中的作用机制

靶向survivin-shRNA在肿瘤治疗中具有多重作用，可以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞分裂增殖，抑制肿瘤血管生成及增加放化疗等敏感性。

3.1抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡 Gou等［10］通过建立survivin-shRNA慢病毒载体转染膀胱癌T24细胞和BJ细胞，用流式细胞术（FCM）来评估膀胱癌细胞的凋亡情况，结果显示大多数T24细胞和BJ细胞在G2/M期被阻滞，显著抑制了T24细胞和BJ细胞的增殖，促进了肿瘤细胞凋亡。

Zhen等［11］构建了靶向survivin-shRNA载体并转染神经胶质瘤U251细胞，体外实验将对数生长期的细胞接种于24孔板，连续7天收集，用Coulter计数器测定细胞数，并绘制生长曲线。结果显示7天后实验组U251-SR细胞比对照组减少（72.0±4.0）%。菌落形成实验将细胞接种到六孔板，培养12天后甲醇固定吉姆萨染色，实验组U251-SR菌落形成率明显低于对照组。FCM分析显示G1期细胞增加，S期细胞减少，且U251-SR组异常细胞较对照组明显增加，细胞有丝分裂发生障碍，凋亡较对照组明显增加。该作者通过建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA进行干预，定期观察并测量肿瘤大小，3周后U251 -SR组肿瘤体积和重量均明显低于对照组。

Xing等［12］用靶向survivin-shRNA质粒转染卵巢癌SKOV3细胞，FCM分析结果显示，survivin-shRNA 组G1/G2期细胞数增多、S期细胞数减少，透视显微镜（TEM）及TUNEL染色结果显示靶向survivin-shRNA促进了肿瘤细胞凋亡、抑制了肿瘤细胞增殖。

Liu等［13］用surviving-shRNA质粒转染前列腺癌DU145细胞，FCM分析结果显示：实验组Psi-svv细胞凋亡数为（10.31±1.23）%，对照组细胞凋亡数为（1.89±0.16）%，明显促进了前列腺癌细胞凋亡。该作者通过建立前列腺癌裸鼠移植瘤，并用survivinshRNA干预，70天后处死裸鼠，测量肿瘤的重量和体积。结果显示：实验组salmonella-psi-svv肿瘤重量为（2.04±0.71）g、肿瘤体积为（671.36±165.11）mm3，对照组肿瘤重量为（6.72±1.53）g、肿瘤体积为（4897.41±1289.37）mm3，可以看出靶向survivin-shRNA明显的抑制了肿瘤组织的生长。

Zhang等［14］用survivin-shRNA干扰肝癌细胞生长实验中，MTT结果显示survivin-shRNA可以明显抑制肿瘤细胞的生长和集落形成。FCM分析结果显示实验组G1期细胞比列增高，G2/M期相应减少，说明survivin-shRNA可引起细胞有丝分裂障碍，使肿瘤细胞凋亡敏感性增加。该作者将survivin-shRNA腺病毒注射入裸鼠肝癌组织内，观察肿瘤生长情况，结果显示靶向survivin-shRNA抑制了肿瘤组织的生长。

还有学者通过研究发现，通过对生存素基因的RNA干扰，能使人类宫颈癌细胞、脑胶质瘤细胞及乳腺癌细胞凋亡率显著增高，增殖速度明显减低［15］。肿瘤细胞的无限制增殖与肿瘤的发生和发展密切相关，因此抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡是肿瘤治疗的主要目的。国内外学者的研究结果充分说明了靶向survivin-shRNA可以抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的作用。

3.2抑制肿瘤血管形成 Zhen等［11］通过建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA进行干预，研究发现，实验组与对照组相比肿瘤细胞增殖指数（proliferation index，PI）和微血管密度（microvessel density，MVD）明显下降，可以看出靶向survivin-shRNA明显抑制了肿瘤血管形成。

Zhang等［16］将构建好的survivin-shRNA质粒转染胃癌细胞SGC-7901，定量聚合酶链反应（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）及蛋白印迹（Western blot）分析显示血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）mRNA水平与survivin mRNA水平呈正相关，当survivin表达下调时VEGF-C表达也下调。结果表明VEGF-C的表达水平受生存素影响，由此可见靶向survivin-shRNA可以抑制肿瘤血管形成。

3.3增加肿瘤对放化疗及药物治疗的敏感性 Hu等［17］通过shRNA下调生存素的表达来观察喉鳞癌细胞对放疗的敏感性，实验通过对荷瘤小鼠进行放疗治疗，每隔4天测量一次肿瘤体积，结果显示survivin-shRNA组肿瘤体积明显小于对照组。这表明靶向survivin的shRNA明显提高了肿瘤细胞对放疗的敏感性。通过shRNA下调survivin来提高喉癌放疗敏感性的同时也可以减少放疗对正常组织的损失，对喉癌的治疗有重大意义。

虽然急性淋巴细胞白血病（ALL）总体预后较过去几十年有所改进，但ALL的耐药性复发仍然是一个亟待解决的问题。Park等［18］通过靶向survivinshRNA来抑制ALL的耐药实验显示，对照组化疗药物长春新碱（vincristine，V）诱导肿瘤细胞凋亡50%的浓度（IC50）是实验组survivin-shRNA的7.5倍。实验通过靶向survivin-shRNA明显提高了其对化疗的敏感性，这对ALL的治疗具有潜在的应用价值。

Xue等［19］构建携带靶向 survivin基因的 shRNA质粒载体，脂质体法转染人卵巢癌细胞株sKOV3和H08910，FCM及MTT结果显示suvivin-shRNA与大黄素联合应用组细胞的增殖率低于单药应用组，凋亡率高于单药应用组。这一结果充分说明转染suvivinshRNA后可以明显提高卵巢癌sKOV3和H08910细胞对大黄素治疗的敏感性。

4　小结

RNA干扰技术具有高效率、高特异性、抑制作用迅速、操作简单、设备依赖性低等优点。生存素靶向治疗可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而对正常组织几乎没有不良影响，这是靶向治疗所特有的优点［20］。RNA干扰在肿瘤治疗方面表现出其他治疗方案无法比拟的优势。RNA干扰技术常用的载体有病毒载体和非病毒载体，由于病毒载体具有易于制备、宿主细胞范围广、转染效率高、理化性质稳定等优点，因此成为基因治疗研究中应用最为广泛的载体，但对于病毒载体的安全性有待进一步研究。

［1］Nikolovska-Coleska Z，Meagher JL，Jiang S，et al.Interaction of a cyclic，bivalent smac mimetic with the x-linked inhibitor of apoptosis protein［J］.Biochemistry，2008，47（37）：9811-9824.

［2］郝玉琴.Survivin与皮肤病的研究进展［J］.中国麻风皮肤病杂志，2011，27（4）：261.

［3］郝玉琴.生存素反义寡核苷酸在恶性肿瘤治疗中的研究进展［J］.中国麻风皮肤病杂志，2012，28（5）：339-341.

［4］Vader G，Medema RH，Lens SM.The chromosomal passenger complex：guiding Aurora-B through mitosis［J］.J Cell Biol，2006，173（6）：833-837.

［5］Altieri DC.Survivin，cancer networks and pathway-directed drug discovery［J］.Nat Rev Cancer，2008，8（1）：61-67.

［6］Wang TT，Qian XP，Liu BR.Survivin：potential role in diagnosis，prognosis and targeted therapy of gastric cancer［J］. World J Gastroenterol，2007，13（20）：2784-2790.

［7］Capalbo G，Rodel C，Stauber RH，et al.The role of survivin for radiation therapy.Prognostic and predictive factor and therapeutic target［J］.Strahlenther Onkol，2007，183（11）：593-599.

［8］曾广丽.RNA干扰技术在医学上的应用前景［J］.医学信息，2013，26（4）：550-552.

［9］Tijsterman M，Ketting RF，Plasterk RH.The genetics of RNA silencing［J］.Annu Rev Genet，2002，36：489-519.

［10］Gou X，Yang HA，He WY，et al.Gene silence-induced downregulation of survivin inhibits bladder cancer cells［J］. Oncol Res，2011，19（12）：535-541.

［11］Zhen HN，Li LW，Zhang W，et al.Short hairpin RNA targeting survivin inhibits growth and angiogenesis of glioma U251 cells［J］.Int J Oncol，2007，31（5）：1111-1117.

［12］Xing J，Jia CR，Wang Y，et al.Effect of shRNA targeting survivin on ovarian cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（7）：1221-1229.

［13］Liu YB，Zhang L，Guo YX，et al.Plasmid-based Survivin shRNA and GRIM-19 carried by attenuated Salmonella suppresses tumor cell growth［J］.Asian J Androl，2012，14 （4）：536-545.

［14］Zhang R，Ma L，Zheng M，et al.Survivin knockdown by short hairpin RNA abrogates the growth of human hepatocellular carcinoma xenografts in nude mice［J］.Cancer Gene Therapy，2010，17（4）：275-288.

［15］Weng CJ，Hsieh YH，Chen MK，et al.Survivin SNP-carcinogen interactions in oral Cancer［J］.J Dent Res，2012，91（4）：358-363.

［16］Zhang J，Zhu Z，Sun Z，et al.Survivin gene expression increases gastric cancer cell lymphatic metastasis by upregulating vascular endothelial growth factor-C expression levels ［J］.Mol Med Rep，2014，9（2）：600-606.

［17］Hu J，Pan J，Luo Z，et al.Downregulation of survivin by shRNA inhibits Invasion and enhances the radiosensitivity of laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Cell Biochem Biophys，2015，72（1）：251-257.

［18］Park E，Gang EJ，Hsieh YT，et al.Targeting survivin overcomes drug resistance in acute lymphoblastic leukemia［J］. Blood，2011，118（8）：2191-2199.

［19］Xue H，Chen Y，Cai X，et al.The combined effect of svvtargeted shRNA and emodin on the proliferation and invasion of ovarian cancer［J］.Anticancer Drugs，2013，24（9）：937-944.

［20］Kanwar RK，Chenug CH，Chang JY，et al.Recent advances in anti-survivin treatments for cancer［J］.Curr Med Chem，2010，17（15）：1509-1515.

（收稿：2015-04-07）

Update of shRNA targeting survivin in the treatment of tumor

ZHANG Xin，HAO Yuqin.
Department of Dermatology，Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China
Corresponding author：HAO Yuqin，E-mail：haoyuqin0472@163.com

［Abstract］Survivin plays an important role in the inhibitor of apoptosis，which is considered as an ideal target for tumor treatment by more and more researchers.shRNA interference technique is targeted on the inhabiting the expression of survivin，so that inhibiting the proliferation of tumor cells，inducing the apoptosis of tumor cells，inhibiting the angiogenesis of tumor and enhancing the sensitivity of tumor cells to radiotherapy and chemotherapy.

surviving；shRNA；tumor

国家自然科学基金资助项目（编号：81260407）

内蒙古医科大学第三附属医院（内蒙古包钢医院），包头，014010

郝玉琴，E-mail：haoyuqin0472@163.com