GeneXpert MTB/RIF技术的应用进展及其在骨关节结核诊断中的价值

李祯 马远征 秦世炳



·综述·

GeneXpert MTB/RIF技术的应用进展及其在骨关节结核诊断中的价值

李祯 马远征 秦世炳

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测体系 (GeneXpert MTB/RIF) 是一套整合核酸准备、扩增、实时检测的完全自动化检测临床标本诊断结核分枝杆菌和利福平耐药的技术，已被美国认可为结核快速分子学诊断技术，世界卫生组织也推荐GeneXpert MTB/RIF在中低收入国家可替代涂片镜检去检测肺结核。GeneXpert MTB/RIF用于检测来自各个肺外结核部位(比如淋巴结)的组织样本都有更好的表现；相比于结核分枝杆菌的培养检测，GeneXpert MTB/RIF在结核病快速诊断中的高敏感度也使其成为一种更好的选择。然而，对于GeneXpert MTB/RIF用于可疑性骨关节结核诊断时，检测脓液标本的推荐数据却相当少。为探讨新的结核病诊断技术在骨关节结核诊断中的可行性，作者将介绍GeneXpert MTB/RIF的检测原理、及其在病原体诊断方面的临床应用和存在问题，以及发展前景。

结核，骨关节； 荧光定量核酸扩增检测技术； 诊断

结核病是一个重要的全球公共卫生问题，对结核病进行及时准确的早期诊断和耐药检测对控制结核病疫情至关重要[1]。肺外结核继发于肺部感染的血源性播散，能使结核分枝杆菌出现在任何解剖部位[2]。在中国，肺外结核约占全部结核病的10%～20%，骨关节结核约占肺外结核病患者的11.3%～34.5%[3]，但现有的骨关节结核诊断技术在诊断的准确性、时间跨度和耐药检测上存在很大限制，使骨关节结核的诊断面临巨大的挑战，以至于很多患者早期大量接受经验性广谱抗生素治疗，而早期判断结核分枝杆菌和耐药情况是结核病提高成功治愈率和降低传染性的首要因素。GeneXpert MTB/RIF是近些年出现的结核分枝杆菌分子检测技术，在2010年9月，为指导GeneXpert MTB/RIF技术的使用，WHO组织专家组对GeneXpert MTB/RIF检测的准确性进行综述性分析，于2011年初推出关于GeneXpert MTB/RIF应用的政策性指南，其在临床工作及结核病控制中的应用也被证实。 Theron等[4]研究结果显示GeneXpert MTB/RIF可由未经专业培训的护士操作，并可提高当日诊断率； Davis等[5]研究认为引进GeneXpert MTB/RIF诊断策略，会降低对非特异性临床症状和标准策略的依赖，参考GeneXpert MTB/RIF检测的高敏感度检测结果，能避免多数不必要的过程(比如经验性四联抗结核治疗及住院治疗天数)，在当前有着较高的诊断准确性及临床应用价值。但GeneXpert MTB/RIF在骨关节结核的检测效能和临床应用的文献却相对较少，笔者根据GeneXpert MTB/RIF检测的分子学原理，及其对肺结核和肺外结核的检测效能，探讨GeneXpert MTB/RIF在骨关节结核诊断中的应用前景。

GeneXpert平台介绍及其技术原理

一、 GeneXpert 平台的介绍

全自动快速分子病原学诊断检测系统GeneXpert由美国国防部资助，拟用于全美邮政系统中炭疽病毒的检测[6]。该系统主要由2部分组成[7]：①Xpert塑料囊盒；②Xpert仪器。其是全球惟一的一套全自动一体化的半巢式荧光PCR检测系统，该系统将PCR检测所需的3个步骤(样品准备、DNA扩增、检测)设定于一体，对样品完全自动化地进行核酸提取、纯化及浓缩，这些复杂步骤都在检测试剂盒内完成，并且扩增与检测也在GeneXpert反应盒中完成。GeneXpert系统对所要检测的DNA序列具有很高的敏感度，加上即时的光学检测软件使得一旦发现目标基因便可以得出结果，极大地减少了检测所需时间。GeneXpert系统应用到结核病诊断领域中被称作Xpert MTB/RIF检测技术，可以在2 h内直接从检测标本中判断是否含有结核分枝杆菌及其对利福平的耐药性，而整个检测过程都在Xpert仪器里进行，处于相对密闭环境中，需要人工操作的时间不超过5 min，所以操作者和周围环境比较安全[8]；一项多中心、随机、对照试验评估了GeneXpert MTB/RIF检测技术的可行性、准确性和临床疗效，结果显示GeneXpert MTB/RIF检测技术可以在初级医疗机构由护士准确操作[4]。

二、GeneXpert MTB/RIF的技术原理

GeneXpert MTB/RIF 试验是以半巢式PCR技术为基础，全自动扩增核酸检测的技术。研究显示，95%以上的利福平耐药结核分枝杆菌有rpoB基因突变，同时所有的利福平敏感结核分枝杆菌在rpoB基因都有相同的核酸序列，说明通过检测rpoB基因可以判断是否存在结核分枝杆菌及利福平耐药[9-10]。故GeneXpert MTB/RIF检测原理是以结核分枝杆菌的利福平耐药基因rpoB作为靶基因。依据靶基因的81 bp核心区设计出5条重叠的探针，同时根据球芽孢杆菌的基因组设计1条对照探针，通过这6条探针的荧光显示结果对标本中的结核分枝杆菌进行检测[11]，当5条检测探针未能与检测基因配对结合，全部无荧光释放，只有第6条探针显示荧光，结果判定为阴性；当5条检测探针能特异的与目标基因序列配对结合，5条检测探针均发出荧光，结果判定为阳性且利福平敏感；当5条检测探针不能完全与目标基因序列配对结合，5条检测探针中有1条或者多条探针未显示出荧光，结果判定为阳性且利福平耐药。考虑到大多数的利福平耐药性结核分枝杆菌也对异烟肼耐药，所以在一定程度上可以通过GeneXpert MTB/RIF检测出的利福平耐药结果判断结核分枝杆菌为耐多药结核分枝杆菌[12]，因此GeneXpert MTB/RIF检测方法可以作为初步判断耐多药结核病的一种技术。

三、GeneXpert MTB/RIF的优缺点

1．GeneXpert MTB/RIF的优势[13]：(1)模块化的平台，操作简单，操作者不需要正规的实验室训练；(2)较高的结核病诊断准确率；(3) 快速出结果(2 h)；(4)同时检测结核分枝杆菌和利福平耐药性；(5)密闭的系统，交叉污染率低，不需要先进的生物安全设备。

2. GeneXpert MTB/RIF的缺陷[14]：(1)Xpert仪器设备和检测用的塑料囊盒较为昂贵，很难实现短时间内普及；(2)GeneXpert MTB/RIF技术只能对部分特定菌种进行检测，限制其使用范围；(3)有时出现利福平耐药性的假阳性结果；(4)只能检测到是否存在结核分枝杆菌的DNA，不能用于检测治疗效果和复发病例；(5)对于细菌含量极少的标本(如脑脊液)检出率很低。

GeneXpert MTB/RIF在结核分枝杆菌及利福平耐药诊断中的应用现况

一、GeneXpert MTB/RIF在肺结核领域的应用进展

GeneXpert MTB/RIF对于肺结核的诊断以及利福平耐药性的判断已经得到深入研究并被广泛接受。2010年，Boehme等[15]应用GeneXpert MTB/RIF 对肺结核的诊断进行了全面的评估，选取1730例疑似肺结核患者进行检测，并与传统痰涂片、阳性痰涂片培养、药敏试验以及传统核酸扩增检测方法相比较，结果如下：(1)对于涂片阳性、培养阳性的临床标本，GeneXpert MTB/RIF的检出率为 98.2% (551/561);对于涂片阴性、培养阳性的标本， GeneXpert MTB/RIF的1次检出率72.1% (124/172)，如果复检2或3次，可使涂片阳性、培养阳性患者的检出率分别达到 90.2%和85.1%。(2) GeneXpert MTB/RIF对于非结核病患者检测的特异性达 87.0% (604/694)。(3)与传统药敏试验相比， GeneXpert MTB/RIF对利福平耐药患者的检出率达97.6%(200/205)，对利福平敏感患者的检出率达98.1%(504/514)，研究结果还显示GeneXpert MTB/RIF可以对未处理的痰标本在2 h内检出结核分枝杆菌及利福平耐药性；同年12月WHO发表声明，认可并推荐GeneXpert MTB/RIF在结核病防治规划中的应用，同时指出， GeneXpert MTB/RIF的出现对肺结核的诊治具有里程碑式的意义[16]。2011年，Boehme 等[17]为了再次验证GeneXpert MTB/RIF，对6648例疑似肺结核患者进行检测，进一步验证了该技术对肺结核诊断和利福平耐药性判断的准确性和有效性。但是2014年Rufai等[18]的一项研究认为GeneXpert MTB/RIF对利福平耐药性检出率较低，会低估耐药结核病的负担，建议根据不同地区设计特异性的探针来增加GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度。

二、 GeneXpert MTB/RIF在肺外结核领域的应用进展

目前，结核病仍然是世界卫生健康的一大挑战，主要原因在于诊断困难，其金标准阳性率低、敏感度差。肺外结核的诊断尤为困难，原因在于肺外结核病灶中结核分枝杆菌数量一般较少，同时不易获得位于人体深部组织的结核病灶的病变标本[19]。因此，相对于肺结核，肺外结核用于诊断的形式较少，诊断更为困难，不利于临床治疗。GeneXpert MTB/RIF是诊断结核病的新技术，目前已在临床中广泛用于痰标本的肺结核诊断，但是其在肺外结核诊断中的价值还没有完全统一认识，因此2013年贾留群等[20]用 Meta分析方法来评估相关学者应用GeneXpert MTB/RIF试验对肺外结核的诊断价值，以期得到GeneXpert MTB/RIF在肺外结核应用的循证医学证据。结果显示，GeneXpert MTB/RIF对肺外结核有较好的特异度，对确诊肺外结核有很好的价值，但是其对于肺外结核诊断的敏感度较差；亚组分析提示GeneXpert MTB/RIF对于不同组织的肺外结核具有不同的诊断价值，提示只有进一步研究GeneXpert MTB/RIF在不同肺外结核组织标本中的诊断应用，才能得到其在不同临床患者诊断中的价值，以更好地指导临床工作。因此，贾留群等[20]提出开展肺外结核不同组织标本检测的大样本研究来进一步证实GeneXpert MTB/RIF试验对肺外结核的诊断价值。在肺外结核中，不同的组织或液体标本在 GeneXpert MTB/RIF 试验中阳性率有所不同。有研究详细评估了GeneXpert MTB/RIF在非呼吸道标本中(脑脊液、胃液、组织、胸水等)诊断肺外结核病的价值[21-23]，结果显示，尽管GeneXpert MTB/RIF试验的检测敏感度尚可(77.3%～95.0%)，但仍以临床综合诊断作为肺外结核病诊断的直接参考标准。尹青琴等[24]对GeneXpert MTB/RIF用于各类结核病的Meta分析显示，肺外结核的总体敏感度为76.0%，不足以筛查肺外结核病，可能与不同肺外结核组织标本中结核分枝杆菌数量多少(如脑脊液的细菌含量较少[25])有关。相对于常规肺外结核检测试验，目前WHO已推荐使用GeneXpert MTB/RIF试验诊断淋巴结和其他组织的结核，以及结核性脑膜炎的首选初始诊断[25]。

GeneXpert MTB/RIF在骨关节结核领域的应用前景

一、GeneXpert MTB/RIF在骨关节结核领域的应用

骨关节结核属于肺外结核常见的一种，其在临床上的诊断是一个难点，很多患者从出现不适症状到最终确诊往往需要几个月到几年的时间，严重影响了治疗的及时性。随着影像学的发展，磁共振成像(MRI)技术辅助诊断骨关节结核的推广使用，使得诊断所需时间有所提前。然而结核病最直接可靠的证据是细菌学诊断，但是骨关节结核病灶不易获得样本且培养阳性率低，使得细菌学诊断在骨关节结核的诊断中没能很好地发挥其作用。GeneXpert MTB/RIF技术通过检测痰标本来诊断肺结核，但由于骨关节结核所提供的标本为脓液和肉芽组织，与肺结核患者的痰标本在性质方面存在较大差异，不同样本类型会对试验结果产生极大影响，再加上不同的样本处理技术也会不同程度地影响诊断准确性，特别是样本均一化步骤对试验准确性的影响。其原因如下：处理不同可能会造成样本颗粒阻塞暗盒阀门影响其在样本容器中的质量，从而引起不同解释的结果；其次会影响细菌载量。因此需针对不同性质标本进行不同处理，尽可能减少样本带来的误差。WHO根据不同组织的预处理做出推荐[27]，骨关节结核标本的预处理可参照处理淋巴结和其他组织的推荐步骤：(1)使用无菌钳和剪刀在一个无菌的研钵中(或在均质器或组织磨床中)将组织标本切成小块；(2)加入大约2 ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS)；(3)用研钵和研杵研磨组织和PBS的混合液(或在均质器或组织磨床中)，直至得到均匀悬浮液；(4)用移液管吸取约0.7 ml的均质悬浮组织液至无菌的锥形螺旋帽管，注意避免将未完全研磨的块状样本移入；(5)用移液管吸取两倍的Xpert样本试剂(1.4 ml)至0.7 ml的均质悬浮组织液；(6) 大力摇晃试管10～20次或涡旋至少10 s；(7)在室温条件下静置10 min，然后再大力摇标本10～20次或涡旋至少10 s；(8)在室温下再次静置样品5 min；(9) 使用新的移液管，吸取2 ml的处理样品到GeneXpert检测盒；(10)按照仪器说明将GeneXpert检测盒放入GeneXpert检测仪。由于不同样本预处理操作提供了GeneXpert MTB/RIF检测的标本基础，使GeneXpert MTB/RIF技术应用在骨关节结核的诊断具有一定的可行性，但是仍需骨关节结核病灶大样本量的研究来进一步证实 GeneXpert MTB/RIF试验对骨关节结核的诊断价值。

二、GeneXpert MTB/RIF技术在骨关节结核领域的应用前景

WHO于2013年推荐GeneXpert MTB/RIF用于诊断肺外结核[28]。2014年李力韬等[29]开展了GeneXpert MTB/RIF对脊柱结核临床标本行结核分枝杆菌与利福平耐药性检测的验证性研究，实验以细菌培养及表型药敏试验为参考标准。结果显示，140例临床诊断的脊柱结核标本中，GeneXpert MTB/RIF检测的阳性检出率为63.57%(89/140)；其中64份培养阳性标本中， GeneXpert MTB/RIF的敏感度为98.44%(63/64)；76份培养阴性标本中，GeneXpert MTB/RIF的敏感度为34.21%(26/76)。表型药敏试验判断的耐药结核中，GeneXpert MTB/RIF对利福平耐药性检测的敏感度为93.33%(28/30)，特异度为94.12%(32/34)。得出的结论是GeneXpert MTB/RIF能够同时对脊柱结核标本行结核分枝杆菌检测与利福平耐药性检测，具有很好的临床应用价值。2015年秦世柄等[30]比较了GeneXpert MTB/RIF和分子线性探针技术(MTBDRplus)在骨关节结核的诊断价值，根据复合参考标准(composite reference standard，CRS)， GeneXpert MTB/RIF、MTBDRplus检测的敏感度分别为82%(41/50)、72%(36/50)，而特异度均为100%。其中对于24例确诊骨关节结核，GeneXpert MTB/RIF和MTBDRplus的敏感度分别为100.00%(24/24)、87.50%(21/24)；22例高度疑似骨关节结核中，GeneXpert MTB/RIF和MTBDRplus的敏感度分别为72.73%(16/22)、63.64%(14/22)；对于疑似骨关节结核患者，GeneXpert MTB/RIF和MTBDRplus检测的敏感度均为25.00%(1/4)；对24例罗氏固体培养基培养阳性的标本进行绝对浓度法药物敏感性试验(DST)，并以DST为参考， GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药符合率为100%。从上述研究结果中可以得出，GeneXpert MTB/RIF有较一致的高特异度，但敏感度有差异且不理想；高特异度表明GeneXpert MTB/RIF技术在肺外结核快速诊断中发挥重要作用，然而，不理想的敏感度可能妨碍GeneXpert MTB/RIF技术在肺外结核中的作用，特别是对于罗氏固体培养基培养阴性、临床怀疑骨关节结核、且GeneXpert MTB/RIF检测结果为阴性标本时，还不能完全排除骨关节结核的可能性，需要进一步做其他相关检测以明确诊断。Denkinger等[26]对18项研究、共计4461例样本进行了综述和Meta分析，由于各个研究中样本类型和前处理措施差异较大，致GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度亦差异较大；在淋巴结或其他穿刺组织中，GeneXpert MTB/RIF与罗氏固体培养法相比的总敏感度为83.1%，与复合参考标准CRS(包括Xpert之外的其他核酸扩增实验、组织学、痰涂片、生化检测、症状或诊断性治疗的反应等)相比的总敏感度为81.2%；在脑脊液标本中，GeneXpert MTB/RIF与培养相比的总敏感度为80.5%，与CRS相比的总体敏感度为62.8%；与CRS相比，GeneXpert MTB/RIF对各类样本的总特异度均>98.7%。由此可见，GeneXpert MTB/RIF技术对于骨关节结核的诊断效能与其在各类肺外结核的总体诊断效能相似，说明了在临床上应用GeneXpert MTB/RIF诊断骨关节结核的可行性，GeneXpert MTB/RIF技术对于骨关节结核的快速诊断有至关重要的作用。

GeneXpert MTB/RIF技术的总结和展望

GeneXpert MTB/RIF对于肺结核的诊断特异度和敏感度已经得到广泛认可，从上述内容可以认为GeneXpert MTB/RIF在肺外结核诊断方面有较高临床应用价值，但还需进一步开展更多试验来验证该技术在不同肺外结核的诊断价值。根据上述国内外学者的研究， GeneXpert MTB/RIF能够提高结核病，特别是痰涂片抗酸杆菌检查阴性结核病的诊断率；减少诊断时间，增加结核病治愈率；降低结核病发病率、死亡率和传染率等，初步验证了其在骨关节结核中的临床应用，可在有条件的医院开展。针对GeneXpert MTB/RIF的普及率低、检测菌种单一、假阳性多等不足，在日后应积极开展提升GeneXpert MTB/RIF检测能力的相关研究，进一步深化GeneXpert MTB/RIF的研究，普及该技术用于各部位结核病的筛查，使其诊断快速、广泛和精准的优势尽早地在临床诊治中得到发挥。

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(本文编辑：孟莉 范永德)

The current application of GeneXpert MTB/RIF assay and evaluate the feasibility of the assays in the diagnosis of bone and joint tuberculosis

LIZhen*，MAYuan-zheng，QINShi-bing.

*ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China

MAYuan-zheng,Email:myzzxq@sina.com

Mycobacteriumtuberculosis/rifampin resistance real-time quantitative nucleic acid amplification detection system (GeneXpert MTB/RIF system) is a set of integrated technique including nucleic acid preparation, amplification and real-time detection for fully automatic detection ofMycobacteriumtuberculosisand rifampin resis-tance in clinical specimens. It has been recognized as a rapid molecular diagnosis method of tuberculosis in USA. World Health Organization recommended that GeneXpert MTB/RIF system could replace the smear to diagnose the pulmonary tuberculsis in low and middle income countries. GeneXpert MTB/RIF was used to detect tissue samples from extra-pulmonary tuberculosis (such as lymph nodes) with better performance. Compared with the mycobacte-rial culture, higher sensitivity of GeneXpert MTB/RIF is a better choice for the rapid diagnosis of tuberculosis. GeneXpert MTB/RIF was used in the diagnosis of suspected bone and joint tuberculosis. However, few detection data of pus specimens are available. To study the feasibility of new diagnostic techniques in the diagnosis of bone and joint tuberculosis, this paper introduces the detection principle, clinical application in the detection of pathogens, exi-sting problems and prospect of GeneXpert MTB/RIF system.

Tuberculosis，Bone and joint； GeneXpert MTB/RIF system； Diagnose

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.019

北京市科技计划课题(D141107005214002)

030001 太原，山西医科大学(李祯)；解放军第三〇九医院骨科中心(马远征)；首都医科大学附属北京胸科医院骨科(秦世炳)

马远征，Email: myzzxq@sina.com

2016-02-17)