循环microRNAs与缺血性脑卒中的研究进展

，

(1.中南大学湘雅医学院2012级检验专业本科生，湖南 长沙 410078；2.中南大学湘雅医学院医学检验系)

·文献综述·

循环microRNAs与缺血性脑卒中的研究进展

郑昭烽1，罗秀菊2*

(1.中南大学湘雅医学院2012级检验专业本科生，湖南 长沙 410078；2.中南大学湘雅医学院医学检验系)

MicroRNAs(miRNAs)是一类真核生物中广泛存在的小分子单链非编码RNA，通过与靶mRNA特异性结合，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，在转录后水平特异性地调控靶基因的表达。miRNAs不仅调节与机体生长发育相关基因的表达，还参与疾病的发生发展过程。循环miRNAs是指血液中游离的miRNAs，有望成为某些疾病(如缺血性脑卒中)的生物标志物。本文将对miRNAs的生物学特性、检测方法及循环miRNAs与缺血性脑卒中的关系做一综述。

循环MicroRNAs； 缺血性脑卒中； 诊断； 生物标志物

非编码RNA是当前生命科学研究的前沿热点之一，其中，microRNAs(miRNAs)是一类长为20～24核苷酸的内源性非编码小RNAs，通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′ UTRs)互补配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，在调节细胞发育和分化、增殖与凋亡等方面发挥重要作用[1]。miRNAs广泛存在于各种生物体内，包括线虫、果蝇、家鼠、植物和人体内[2]。研究发现，不同的疾病状态下(如肿瘤、糖尿病、心血管疾病和中风等[3-5])，一些miRNAs的表达水平可出现特征性的变化(如升高或者降低)，通过对miRNAs表达谱的检测有助于疾病的诊断。循环miRNAs指血液中游离的miRNAs，具有稳定性高等特点。血浆或血清中循环miRNAs检测具有创伤小、灵敏度高、样本收集程序简便、一个样本可同时检测多项参数等优点，有望成为一种新型的生物标志物。缺血性脑卒中是脑血流供应障碍所致的脑部病变，是世界范围内的重大公共卫生问题，已经成为全球第二大致死原因和致残的首要原因[6]。近年发现miRNAs与缺血性脑卒中密切相关，本文主要对miRNAs的生物学特性、检测方法及循环miRNAs与缺血性脑卒中的关系做一综述。

1 miRNAs

最早被人类所认识的miRNAs是lin-4和它的靶mRNA，lin-14。1993年，Lee等人[7]通过遗传学方法在线虫体内发现了这种小分子RNA-lin-4。Lin-4并不编码蛋白质，而是通过与lin-14 mRNA的3′非翻译端(UTR)特异性结合，抑制lin-14 mRNA的表达，从而减少lin-14蛋白水平。2000年，Reinhart[8]等人在秀丽杆状线虫体内发现了具有时序调控功能的小分子非编码RNA-let-7，let-7长为21 nt，也是第二个被发现的miRNAs。很快在其他两侧对称动物包括哺乳动物中也发现了let-7的同系物，其与线虫体内let-7的表达类似，表明miRNAs可能是一类保守且具有基因调控功能的小分子物质[9]。许多实验室陆续发现了更多的miRNAs。目前普遍认为，在动物体内，miRNAs基因在细胞核内由RNA聚合酶II(polII)转录为具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾(AAAAA)的pri-miRNAs。pri-miRNAs在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被剪切成70～100个核苷酸大小的具有发夹结构的pre-miRNAs，再由RNA-GTP和exportin 5将pre-miRNAs输送到胞质中。Pre-miRNAs在核酸酶Dicer作用下，剪切为成熟的miRNAs。后者被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中，与靶mRNA通过碱基配对结合，引起靶mRNA的降解或转录后的翻译抑制[2]。推测，miRNAs调控着超过1/3的人类基因的表达[2]。miRNAs在各个物种间保持高度保守性,且具有一定的组织特异性。在不同组织中，miRNAs的分布与表达存在差异。如miR-122在肝脏中高度表达，而在其他器官组织中表达很低[10]。

miRNAs可在外周血中稳定存在，能抵抗核糖核酸酶(RNase A)的消化作用。2008年，Lawrie[11]等人发现miR-21可以在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血液中稳定存在，miR-21成为第一个发现的循环miRNAs。循环miRNAs来源于正常的外周血细胞或患病的组织细胞，如肿瘤、炎症等[12]。组织中miRNAs进入血液循环的方式至少包括被动释放和主动分泌，以主动分泌为主。当组织损伤时，miRNAs从凋亡或破碎细胞中被动释放。主动分泌具有两种形式，即直接分泌游离的miRNAs或通过囊泡的形式分泌到胞外[13]。血液中miRNAs通常与蛋白质结合在一起，无论在室温条件下操作还是反复冻融都很稳定。在特定疾病中血液中miRNAs的表达谱会发生变化,因此，循环miRNAs有望成为具有广大前景的疾病诊断与预后的分子标志物，如在结肠癌患者中[14]，血浆miR-21、miR-135b和miR-141显著升高，可作为结肠癌筛查的分子标志物，而循环miR-155则具有早期诊断食道癌的作用[15]。

2 循环MicroRNA的检测方法

目前有多种方法可以检测和鉴定miRNAs，如，Northern blot、DNA微阵列芯片、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)等。Northern blot是检测miRNAs表达的经典方法[16],其基本原理是通过电泳将miRNAs分开，再转移到膜上，与特定基因互补片段的探针杂交后显影即可完成对miRNAs的检测。Northern blot可以同时测定miRNAs的相对分子质量和丰度，具有较高的特异性。该方法操作繁琐、费时且灵敏度低，其应用受到限制，一般不适用于临床的大规模筛查。DNA微阵列芯片(基因芯片)，能一次反映上千个基因的表达变化，是一种高通量的检测方法,可与Northern blot联合使用。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)是检测miRNAs的最常用的方法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[17]。

3 循环miRNAs与缺血性脑卒中

缺血性脑卒中是由于各种原因引起的脑部血液供应障碍，使局部脑组织发生不可逆性损害，导致脑组织缺血、缺氧性坏死，而出现相应神经功能缺损的一类临床综合征。具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点。早期准确诊断缺血性脑卒中，及时给予抗凝、溶栓等治疗，对减少缺血性脑卒中的致死致残率意义重大。目前对缺血性脑卒中的诊断主要依赖患者临床表现和影像学检查，不仅需昂贵的设备，而且往往会错过最佳诊治时机。近来研究发现，miRNAs参与了缺血性脑卒中发生发展的病理过程，包括动脉粥样硬化、脑水肿、缺血—再灌注损伤及脑梗死后血管新生等[18-19]。因此，循环miRNAs检测有望为急性缺血性卒中的早期诊断、治疗干预提供新的思路和潜在的治疗靶点。

大鼠脑缺血—再灌注损伤模型中，缺血后再灌注24 h后，大鼠血浆中miR-19b、-290、-292-5p水平升高，而miR-103水平则明显降低，提示这些miRNAs可能与脑缺血损伤相关;再灌注48 h后，血浆及脑组织中出现新的miRNAs变化，可能反映了脑损伤的恢复修复状况[20]。研究显示，再灌注24 h和48 h后，有10种miRNAs在血浆和脑组织中的变化水平趋于一致，如miR-290、let-7i等。已知脑组织中存在多种特异表达的miRNAs，检测血浆中脑特异性miRNAs对缺血性脑卒中的诊断意义更大。在大鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO)中，血浆脑特异性miR-124在缺血6h后即开始升高，一直持续到48 h[21]。miR-124参与了神经元分化、神经生长发育以及脑组织损伤后的调控[22-23],因此，血浆中miR-124水平升高与脑损伤修复密切相关。我们最近研究发现,MCAO大鼠血浆miR-107水平显著上升，与血浆谷氨酸水平呈正相，进一步证实血浆中某些miRNAs可能是缺血性脑卒中潜在的诊断标志物和治疗靶点[24]。

虽然已知众多miRNAs(如miR-124、miR-107)可能参与了缺血性脑卒中的发生发展，但能否通过监测外周血miRNAs水平变化反映缺血性脑损伤情况是临床上普遍关心的问题。Gan[25]等人发现循环miR-145水平在缺血性脑卒中患者中明显升高；利用实时荧光定量PCR检测缺血性脑卒中患者外周血脑特异性的miR-107、miR-128b、miR-137和miR-153的水平，发现miR-107、miR-128b和miR-153表达上调，提示其有可能成为缺血性脑卒中诊断的潜在生物标志物[24,26]。Tan,等[27]用基因芯片检测青年缺血性脑卒中患者血液中836种miRNAs，发现157种miRNAs在脑卒中患者中的表达发生改变，其中17种miRNAs(如hsa-let-7e、miR-1184、-1246、-1261、-1275、-1285、-1290、-181a、-25*、-513a-5p、-550、-602、-665、-891a、-993、-939、-923)在各个亚型中均高表达,比如大血管动脉硬化型(LA)、小血管疾病型(SA)、心源性栓塞型(CEmb)及病因未明型脑缺血(UND)，而8种miRNAs(hsa-let-7f、miR-126、-1259、-142-3p、-15b、-186、-519e、-768-5p)在LA、SA和CEmb组中表达明显下调。生物信息学分析表明这些变化的miRNA可参与细胞增殖、止血、氧化应激和炎症等过程[28,29]，合并所有亚型分析显示，miRNAs下调数目较多的脑卒中患者预后相对较好。龙光文,等[30]的研究发现miR-30a、miR-126和let-7b(let-7b-LA)在缺血性脑卒中患者中表达显著下调，而Let-7b(let-7b-SA、let-7b-CEmb和let-7b-UDN)表达上调,miR-30a、miR-126和let-7b在诊断缺血性脑卒中具有很高的特异性和敏感性。以上的研究提示，脑卒中后miRNAs表达谱的改变，可为脑卒中病因鉴别及预后判断提供依据。此外，缺血性脑卒中患者miRNAs存在多态性的改变。Jeon等[31]对678例脑卒中患者miRNAs多态性分析发现miR-146a C>G位点多态性和miR-146aG/-149T/-196a2C/-499G等位基因组合与脑卒中发生密切相关，且miR-146a C>G位点多态性增加血压正常的非糖尿病女性人群脑卒中的风险。

4 结 语

虽然目前很多研究表明循环miRNAs表达水平异常与缺血性脑卒中相关，但二者之间的因果关系仍不清楚。目前尚未有直接证据表明循环miRNAs表达异常是缺血性脑卒中导致的结果，其中的机制还待进一步探究。随着循环miRNAs检测方法的完善，循环miRNAs生物学特征、作用机制以及与缺血性脑卒中的关系的进一步阐明，在不久的将来，循环miRNAs有望应用于临床实践，为缺血性脑卒中早期诊断并其预后判断发挥巨大的价值。

[1] Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009.136(2):215-233.

[2] Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[3] 梁健球.关于心肌梗死后心力衰竭患者血浆中miRNA表达及基于ECHO的心肌能量消耗的研究[D].广州：南方医科大学,2013:8-46.

[4] 李靖.前列腺癌异常表达microRNAs的筛选及miRNA-182作用机制的初步研究[D].天津：天津医科大学,2014:3-10.

[5] 蒋涛涛,孙波,沈梅，等.miRNA在重度子痫前期与正常妊娠胎盘组织中差异表达的研究[J].中国实验诊断学,2015,19(10):1707-1710.

[6] Romano JG,Sacco RL.Decade in review-stroke:progress in acute ischaemic stroke treatment and prevention[J].Nat Rev Neurol,2015,11(11):619-621

[7] Rosalind CL,Rhonda LF,Victor A.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[8] Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,et al,The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[9] Pasquinelli AE,Reinhart BJ.Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA[J].Nature,2000,408(6808):86-89.

[10] Butt AM,Raja AJ,Siddique S,et al.Parallel expression profiling of hepatic and serum microRNA-122 associated with clinical features and treatment responses in chronic hepatitis C patients[J].Sci Rep,2016,6:21510.

[11] Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2008,141(5):672-675.

[12] 谢沛.血浆miR-216a高表达在急性胰腺炎中的临床意义[D].上海：第二军医大学,2013:37-39.

[13] Kosaka N,Ochiya T.Unraveling the Mystery of Cancer by Secretory microRNA:Horizontal microRNA Transfer between Living Cells[J].Front Genet,2012,2:97.

[14] 姜训圳,赵科,何向辉，等.miRNA-21、miRNA-135b、miRNA-141在结肠癌中的表达及其意义[J].中国普通外科杂志,2014,23(10):1367-1372.

[15] Liu R,Liao J,Yang M,et al.Circulating miR155 Expression in Plasma:A Potential Biomarker for Early Diagnosis of Esophageal Cancer in Humans[J].J Toxicol Environ Health A,2012,75(18):1154-62.

[16] 叶燕,申娴娟,鞠少卿，等.微小RNA检测方法的研究进展[J].中华检验医学杂志,2013,36(8):689-692.

[17] 李万琴,贺荣芳,甘润良，等.miRNA的检测方法概述[J].临床与病理杂志,2015,35(7):1413-1417.

[18] Jianhua Zhu,Ting Chen,Lin Yang,et al.Regulation of MicroRNA-155 in Atherosclerotic Inflammatory Responses by Targeting MAP3K10[J].PLoS One,2012,7(11):e46551.

[19] Li Q,He Q,Baral S.et al.MicroRNA-493 Regulates Angiogenesis in a Rat Model of Ischemic Stroke by Targeting MIF[J].FEBS J,2016,1.

[20] Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A． MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion[J]．Stroke，2008，39(3):959-966．

[21] Weng H,Shen C,Hirokawa G,et al.Plasma miR-124 as a biomarker for cerebral infarction[J].Biomed Res,2011,32(2):135-141.

[22] Liu XS，Chopp M，Zhang RL，et al． MicroRNA profiling in subventricular zone after stroke:MiR-124a regulates proliferation of neural progenitor cells through Notch signaling pathway[J].PLoS one,2011,6( 8):e23461．

[23] Hamzei Taj S,Kho W,Riou A,et al.MiRNA-124 induces neuroprotection and functional improvement after focal cerebral ischemia[J].Biomaterials,2016,91:151-165.

[24] Yang ZB,Zhang Z,Li TB,et al.Upregulation of brain-enriched miR-107 promotes excitatory neurotoxicity through downregulation of glutamate transporter 1 expression following ischemic stroke[J].Clin Sci (Lond),2014,127(12):679-689.

[25] Gan CS,Wang CW,Tan KS.Circulatory microRNA-145 expression is increased in cerebral ischemia[J].Genet Mol Res,2012,11(1):147-152.

[26] 张真.急性脑梗死患者外周血脑特异性miR-128b、miR-137和miR-153的表达变化研究[D].长沙：中南大学,2014:5-19.

[27] Kay ST,Arunmozhiarasi A.Expression profile of microRNAs in young stroke patients[J].PLoS One,2009,4(11):e7689.

[28] Tan JR，Tan KS，Koo YX，et al．Blood microRNAs in low or no risk ischemic stroke patients[J].Int J Mol Sci，2013,14 (1):2072-2084．

[29] 马丽娟,周健,汪俊军.MicroRNAs—缺血性脑卒中潜在的诊断标志物及治疗靶点[J].临床检验杂志,2013,8:603-605.

[30] 龙光文.血循环miRNAS与急性心肌梗死和缺血性脑卒中相关联[D].武汉：华中科技大学,2014:1-65.

[31] Jeon YJ，Kim OJ，Kim SY，et al． Association of the miR-146a，miR-149，miR-196a2，and miR-499 polymorphisms with ischemic stroke and silent brain infarction risk[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33( 2):420-430．

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.032

2016-03-12；

2016-04-22

国家自然科学基金 (81573430)，湖南省自然科学基金(2015JJ2156)资助.

*通讯作者，E-mail:xjluo22@csu.edu.cn.

R743

A

秦旭平)