深低温冷冻灭活技术在骨肉瘤保肢治疗中的应用及进展

刘斌 综述 袁振超 审校

骨肉瘤是一种好发于儿童及青少年时期的恶性肿瘤。从上世纪70年代起，随着影像诊断技术、放疗、化疗、外科重建技术的进步，骨肉瘤患者的生存率有了较大提高，5年生存率提高至60%～80%［1］。目前对骨肉瘤切除后大块骨缺损的重建有较多选择，包括肿瘤假体重建、同种异体骨重建、复合异体骨假体置换、牵张成骨、肿瘤自体骨灭活回植等，从而避免了截肢。肿瘤自体骨灭活回植需要放疗灭活［2］、高压灭菌［3］、巴氏消毒灭活［4］、无水酒精灭活、深低温冷冻灭活等处理，其中一些灭活方法可导致骨强度及骨诱导能力减弱［5］。深低温冷冻灭活能够最大程度保留骨的强度及骨的诱导生成能力，是一种具有广泛应用前景的生物保肢技术，能较大程度地避免其他保肢方法产生的诸多并发症，有着良好的临床应用前景。现就此项技术的临床应用及进展作一综述。

1 深低温冷冻灭活原理

深低温冷冻灭活可直接导致细胞膜及细胞器被破坏从而间接引起微小血管的血栓形成［6，7］。伴随着温度的降低，细胞发生高度浓聚、脱水及蛋白质变性，导致细胞膜及细胞内的酶促机制受到破坏；随着温度的快速下降，细胞内冰晶形成，细胞膜和细胞器的机械通道被破坏、损伤。经反复循环冷冻后，组织之间的传导增加，扩大了对组织的破坏。细胞的间接损害是由于冷冻后血管局部缺血，导致细胞死亡。血管壁损伤可能的原因是血管周围的细胞水合作用，导致周围血管扩张和机械性损伤或直接损伤血管内皮细胞。两种途径最终导致渗透性增加、水肿和凝血级联，从而引起血管和组织局部缺血或形成微血栓。此外，再灌注损伤在细胞损伤中也起着重要作用［8］。

2 深低温冷冻灭活技术及演变

Marcove等［9］在1968年首次报道冷冻治疗原发和转移性骨肉瘤，包括动脉瘤样骨囊肿、骨巨细胞瘤、软骨母细胞瘤、软骨肉瘤、恶性骨肿瘤和骨肉瘤。具体流程：刮除瘤腔后，将液氮灌入刮除骨腔，然后再解冻，反复2～3次，以求获得最大的组织坏死，但这种方法很难处理肿瘤的边缘。Tsuchiya等［10］开创了一种新的冷冻方法，将经液氮处理的瘤体包绕骨肉瘤用于重建，具体方法：将离体骨肉瘤周围的软组织及肿瘤组织去除后钻孔，放置于液氮中20 min，室温下解冻15 min，再置蒸馏水解冻10 min，然后用内固定髓内钉或复合人工假体置换，取得良好的临床应用效果。并在此基础上改良了冷冻灭活的手术方式，将肿瘤的一端离断后，充分刮除骨髓腔内肿瘤组织，将周围正常组织充分保护后，直接置于液氮中冷冻处理，从而保证了瘤骨连续性，以利于术后恢复，降低术后病理性骨折及术中冷冻过程中自体瘤骨冻裂的风险。不过此种处理方式也有弊端，如髓腔内肿瘤组织有可能沿着髓腔形成医源性肿瘤组织术中播散。此外，Chen等［11］对早期骨肉瘤患者开展半皮质局部切除生物重建技术，选取6例病灶边缘至少离对侧骨皮质1 cm，AJCC分期为Ⅱa期且对肿瘤化疗敏感的患者，其中3例患者经冷冻灭活处理，术后所有患者无机械性固定失败及感染，恢复满意，术后平均随访52个月未见局部复发及转移。因此认为，深低温冷冻灭活作为一种有效的灭活保肢技术，特别是在儿童骨肉瘤保留骨骺保肢治疗有较大的应用前景。

3 深低温冷冻灭活的免疫学进展

Nishida等［12］报道了经液氮冷冻灭活的小鼠肿瘤组织回植肿瘤小鼠后引起系统性抗肿瘤免疫反应，其中部分肿瘤小鼠加用免疫调节剂OK-432，其抑制转移瘤的生长效果明显，表明免疫调节剂可能协同提高抗肿瘤疗效。Kawano等［13］报道肿瘤冷冻灭活组织与树突状细胞（DC）能协同提高肿瘤特异性免疫和抑制转移灶增长。此外，Nishida等［14］报道1例17岁全身多发骨转移骨肉瘤女性患者，经过标准化疗后，进行广泛的右侧股骨手术切除及液氮灭活复合重建，术后经化学辅助治疗，DC免疫治疗2次，肺部转移灶稳定12个月，骨盆转移灶得到部分缓解，患者2年后死亡。

4 深低温冷冻灭活技术的优缺点

像其他生物重建一样，深低温冷冻灭活技术有着其自身优点和缺点。优点包括手术操作简单，成本低廉，保留了骨诱导和骨传导的性能，灭活回植物与宿主骨接触充分，生物力学得到保留，灭活回植骨强度大，易与周围肌腱及韧带粘连，增强了关节的稳定性，无疾病传播风险，可以增强抗肿瘤的免疫反应［10，12］。此外，由于冷冻回植重建涉及使用灭活的瘤骨，灭活回植的强度依靠回植骨结构的完整性，出于这种原因，使用自体瘤骨灭活回植的条件是肿瘤为成骨性病变并且无大范围的融骨现象发生。缺点为不能行化疗后肿瘤坏死率及整个标本的病理分析，术后并发症包括关节软骨的退行性改变、感染、骨不连、骨折等［10，15］。究其原因考虑与冷冻、解冻步骤相关，其中快速冷冻和缓慢解冻可导致组织破坏［16］，而慢速冷冻和快速解冻可以更好地保留组织的完整性，降低移植骨溶解的可能［17］；感染、骨不连、骨折的发生与周围软组织的广泛切除后乏血供有关，Capanna等［18］发现自体腓骨复合移植能够显著降低上述并发症的发生。

5 展望

深低温冷冻灭活回植技术和外科手术不断创新发展及新冷冻设备的不断推出，为骨肉瘤生物保肢的应用提供了更为先进的技术支持，使深低温冷冻灭活回植治疗骨肿瘤逐渐成为当下研究的热点，但目前对于深低温冷冻治疗确切的作用机制尚未完全了解。尽管已有大量基础研究显示深低温冷冻治疗在骨肿瘤治疗中的应用价值，但基础研究的实验数据能够多大程度地转化为临床应用尚需实践检验。因此，对深低温冷冻治疗的作用机制和临床应用值得进一步深入研究。

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