骨形态发生蛋白-6对过氧化氢造成的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

陈　丽，刘　明，刘　勇，张德秀



·实验研究·

骨形态发生蛋白-6对过氧化氢造成的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

陈丽1，刘明2，刘勇3，张德秀1

Protective effect of bone morphogenetic protein 6 on RPE cells injury caused by H2O2

Citation:Chen L, Liu M, Liu Y,etal. Study of the protective effect of bone morphogenetic protein 6 on RPE cells injury caused by H2O2.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):37-40

摘要

目的：观察骨形态发生蛋白-6(bone morphogenetic protein，BMP-6)对过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)作用的人视网膜色素上皮株ARPE-19细胞的细胞形态、增殖以及凋亡的影响。

方法：常规培养ARPE-19细胞，分为正常对照组、75μmol/L H2O2及150ng/mL BMP-6、75μmol/L H2O2+150ng/mL BMP-6环境中培养3、6、9、12h后，MTT比色法检测细胞的活性；流式细胞仪检测细胞的周期及凋亡变化。

结果：H2O2作用组的细胞活性随着作用时间的延长逐步降低；而BMP-6+H2O2组的细胞活性则较H2O2组高，在3h及6h时两组相比差异有统计学意义(P<0.05)；细胞形态观察发现：H2O2培养6h后，细胞数量减少，细胞发生脱落，而添加BMP-6后细胞脱落及凋亡均要明显减少。

结论:BMP-6可以一定程度上保护视网膜色素上皮受到氧化应激的损伤。

关键词：骨形态发生蛋白-6；氧化应激；年龄相关性黄斑变性；过氧化氢

引用：陈丽，刘明，刘勇，等.骨形态发生蛋白-6对过氧化氢造成的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用.国际眼科杂志2016;16(1):37-40

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一项进行性地损伤中央视力的疾病，可以导致光感受器细胞和视网膜色素上皮的变性，进而导致脉络膜新生血管突破Bruch’s膜[1]。大量研究结果提示，氧化应激是AMD发生和发展的一个重要的促进因素[2]。在AMD患者中，视网膜中铁的聚集可以加剧它的病程[3]。已有研究证实，骨形态发生蛋白-6(bone morphogenetic protein-6，BMP-6)是系统性铁的主要调节因子[4]。BMP-6可否保护视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)使其免受氧化应激的损伤鲜见报道。本实验拟进一步研究BMP-6对RPE细胞的抗氧化作用，探讨BMP-6用于防治AMD的可能性。

1材料和方法

1.1材料人视网膜色素上皮细胞(RPE细胞株购自美国ATCC公司)，DMEM培养基(美国Sigma)，胎牛血清(FBS，美国Hyclone，USA)，胰蛋白酶(Amersco，USA)，过氧化氢(远大过氧化物有限公司，上海)，骨形态发生蛋白-6(BMP-6，美国Sigma)；流式细胞仪(型号FACS Calibur，BD公司,USA)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组ARPE-19细胞培养：取出装有ARPE-19细胞株的细胞冻存管，迅速置于37℃水浴中解冻，将细胞悬液移入离心管中，加入5mL含15%新生牛血清的DMEM/F12培养液，1 000r/min离心5min，弃上清，加入5mL含15%新生牛血清的DMEM/F12培养液，经细胞计数，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种入50mL细胞培养瓶中，将其置于5% CO2，95%空气、湿度90%的CO2培养箱中培养，24h后观察细胞情况。取生长状态良好的细胞，常规DMEM培养，次日贴壁生长后更换为无血清培养液培养24h后，分为：(1)正常对照组；(2)H2O275μmol/L组；(3)H2O275μmol/L+BMP-6作用组(150ng/mL)；(4)BMP-6(150ng/mL)作用组；各作用0、3、6、9、12h。

1.2.2细胞的形态学观察RPE细胞消化、传代后以1×104个/孔的细胞密度接种于6孔板中，静置培养24h后吸弃上清，更换为无血清培养液，同步化处理24h，分为正常对照组、H2O2组、BMP-6组及H2O2+BMP-6组作用3、6、9、12h。在倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态学变化，并采集图像。

1.2.3 MTT法测定细胞的活性将RPE细胞以5×104个/mL细胞密度接种于96孔板中，次日贴壁生长后按照实验分组加入试剂：(1)氧化损伤组加入H2O275μmol/L，(2)H2O275μmol/L+BMP-6(150ng/mL)作用组，(3)BMP-6(150ng/mL)作用组，各作用0、3、6、9、12h。呈色：每孔加MTT溶液(5mg/mL，用pH=7.4的PBS配)20μL。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，置于摇床上低速振荡使结晶物充分融解。比色：选择492nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.2.4流式细胞仪测定细胞的周期及凋亡变化分组：(1) 正常对照组；(2)氧化损伤组加入H2O275μmol/L；(3)H2O275μmol/L+BMP-6(150ng/mL)作用组；(4)BMP-6(150ng/mL)作用组，作用12h。收集细胞，1 000r/min离心5min，弃上清液。用PBS溶液清洗3次，用70%乙醇混匀固定，4℃过夜，PBS再清洗细胞 30min，在离心管中留1mL PBS，仔细打散细胞团，加入RNase A 5μL(1mg/mL)，37℃温浴30min，加入500μL含50μg/mL溴化乙锭的PBS，室温避光30min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况及凋亡情况，获取软件：CellQuest Pro；分析软件：Modifit LT。重复3次。

图1H2O2及H2O2+ BMP-6不同作用时间组细胞活性的比较aP<0.05vs同时间点H2O2组;bP<0.01vs同组0h。

2结果

2.1细胞活性分析MTT法检查结果(图1)显示，在作用3、6、12h时方差齐性检验均为P>0.05，表示具有方差齐性，所以多重比较采用LSD-t检验，在作用3、6、12h时组间差异均有统计学意义(P<0.05)；而组内比较发现：在3h和6h时H2O2与H2O2+BMP-6比较差异有统计学意义(P<0.05)，而在12h时H2O2与H2O2+BMP-6比较差异无统计学意义(P=0.928>0.05)。在9h作用组行方差齐性检验发现P=0.01<0.05，表示不具有方差齐性，所以多重比较采用Tamhane’s检验，结果在作用9h时组间差异均有统计学意义(P<0.05)，在作用9h时H2O2组与H2O2+BMP-6组比较差异无统计学意义(P=0.946>0.05)。

2.2 RPE细胞形态的变化倒置相差显微镜下观察，正常的人RPE传代后4h开始呈贴壁生长，贴壁良好的细胞呈纺锤形或梭形，细胞内颗粒分布均匀(图2A)。可见，H2O2作用组，RPE细胞的细胞体皱缩、变圆，呈空泡状，部分细胞脱壁(图2H6)。而单纯BMP-6作用组可看到细胞状态良好，细胞密度变大(图2B6)。而添加BMP-6的H2O2作用组可以看到细胞体皱缩，变圆空泡现象较单纯H2O2组有所改善(图2HB6)。

2.3流式细胞分析细胞周期及凋亡的结果各组作用12h后，用流式细胞分析细胞周期及凋亡。由表1及图3可以看出，正常对照组、H2O2组、BMP-6组、H2O2+BMP-6组作用12h时凋亡率分别为4.83%、32.63%、4.86%、23.67%；进行方差齐性检验发现具有方差齐性，组间比较采用LSD-t检验：BMP-6组与正常对照组无统计学差异(P=0.97>0.05)；其余两两比较均有统计学差异(均P<0.05)。可以看出，H2O2可以加剧视网膜色素上皮细胞的凋亡，单独添加BMP-6作用后凋亡率与正常对照组无统计学差异，而BMP-6则可以对抗H2O2促进视网膜色素上皮细胞的凋亡作用。细胞周期的分析中我们可以看出，H2O2组G2+S期的细胞比例明显增加，而G1期的比例明显降低。

3讨论

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是与年龄相关的视网膜脉络膜中心区域(黄斑区)的光感受器-视网膜色素上皮(RPE)-Bruch膜-脉络膜毛细血管复合体的进展性病变，可导致中心视力的丧失。AMD严重影响生活质量，由于中心视力丧失，患者生活不能自理，同时造成沉重的社会经济负担。目前AMD的病理过程并不是很清楚，认为与氧化应激及炎症有关。视网膜组织由于耗氧量高、富含多不饱和脂肪酸、且暴露于光照，成为氧化应激的高度易感部位[5]。

图2RPE细胞形态的变化(×200)A：正常对照；H3：H2O2组3h；H6：H2O2组6h；B3：BMP-6组3h；B6：BMP-6组6h；HB3：H2O2+ BMP-6组3h；HB6：H2O2+ BMP-6组6h。

图3培养12h后各组细胞周期及凋亡的检测结果A：对照组；B：H2O2组；C：BMP-6组；D：H2O2+BMP-6组。

表1各组作用12h后RPE 细胞周期各时期比例的变化

，%，n=3)

aP<0.05vs正常对照组。

过氧化氢是一种重要的活性氧，外源性过氧化氢极易通过细胞膜进入细胞，在细胞内过渡金属存在时通过Fenton反应，形成高活性的自由基，如单态氧、羟自由基等，进一步造成细胞损伤。因其操作简单，容易控制，现广泛用于体外模拟细胞的过氧化损伤实验[6]。铁是一种潜在的氧化剂，过量的铁可以启动Fenton反应，催化H2O2形成羟自由基，进而导致脂质过氧化、DNA键断裂、细胞降解，导致组织破坏[7]。

在视网膜中，光传导级联反应中涉及多种铁相关蛋白。RPE65，在RPE中表达的与铁相关的蛋白，在视觉循环中负责所有酯转化为11顺式视黄醇。光感受器细胞不断地流出及合成它们的外节盘,因而很大程度依赖于脂肪酸去饱和酶(一种膜脂质合成所必须的铁相关蛋白)。同其他细胞一样，视网膜细胞容易受到过量铁导致的氧化应激的损害。过量铁可以损害RPE的吞噬作用。铁是鸟苷酸合成cGMP(光传导途径的二级信使)所必须的。长期暴露于光线，光致氧化作用在视网膜中产生了超过正常水平的反应氧化产物。二十二碳六烯酸，这种组织丰富的多元不饱和脂肪酸，易受脂质过氧化反应的影响在自由基之前，进而影响视网膜的功能。基于这些原因，铁平衡的调节在视网膜中有很重要的作用，铁平衡的破坏将产生严重的生物及临床后果[8]。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetie proteins，BMPs)是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，它们最初是作为能够在体内诱导骨和软骨形成的因子为人们所认识的。但随着分子生物学研究的深入，对BMPs家族成员的研究日益深入和扩展，已发现BMPs广泛分布于人体多种组织和细胞，对靶细胞的生长、分化以及凋亡具有调控作用，在机体胚胎生长发育、创伤愈合、机体肿瘤的发生发展等过程中起重要作用[9]。有研究表明，BMPs在眼的发育和眼疾病中发挥着重要作用，参与视觉系统发生、发展的各个阶段。BMP-6具有独特的结构及功能特征，其作用复杂，参与调节体内多种代谢过程，不仅在维持生理功能上具有重要作用，而且还介导了许多疾病的发生，因此对BMP-6的研究越来越受人们的重视[10]。

新近研究发现，BMP-6是影响机体铁代谢的重要调节因素。这一发现不仅丰富了机体铁代谢及其调控的理论知识，还可尝试运用BMP-6的调控作用治疗铁代谢相关疾病[11]。在鼠眼内进行BMP-6蛋白注射，可以上调铁调素进而改变视网膜铁的水平。BMP-6敲除小鼠会产生剂量依赖性的视网膜内铁的积聚和变性[12]。尸检发现，早期黄斑变性患者视网膜色素上皮细胞中BMP-6的水平明显下降。早期AMD中BMP-6水平的降低可以导致在AMD中铁离子的集聚[13]。Majda等[14]研究发现，在体内及体外，氧化应激可以下调BMP-6 mRNA的表达。运用H2O2作用于体外培养的RPE后，BMP-6 mRNA的表达明显下降。

既然氧化应激导致的BMP-6的下调已被证实与AMD有关。那么体外添加BMP-6可否保护RPE细胞受到氧化应激的损伤，我们实验观察75μmol/L H2O2对体外培养的RPE的增殖抑制作用及促进凋亡的作用，且这种作用具有时间依赖性。单纯150ng/mL BMP-6可以呈时间依赖性地对RPE细胞有轻微的促增殖作用。添加BMP-6可以阻止H2O2对RPE细胞的氧化损伤。在作用3h和6h时，H2O2+BMP-6组与H2O2组相比较差异有统计学意义，可以看出，BMP-6早期是可以阻止H2O2对RPE细胞的氧化损伤。在随后的细胞形态观察中发现，作用3h和6h时，H2O2组细胞明显皱缩及脱落，H2O2+BMP-6组细胞脱落及皱缩现象有所减少。在流式细胞仪检查中发现，作用3h和6h时，H2O2+BMP-6组的凋亡率均较H2O2有所降低。在本实验中发现，75μmol/L H2O2可以缩短G1期时相，加快细胞周期的进程。既往研究氧化应激对细胞周期的影响表明，根据细胞类型的不同、细胞培养条件的不同及氧化应激水平的不同，细胞周期的阻滞是多向的[15]：有的是阻滞于G1期，有的是G2期[16]。我们研究发现，H2O2可以促进细胞的凋亡，可以使细胞阻滞于G2+S期，而BMP-6可以逆转这种阻滞。

综上所述，体外培养的RPE细胞中，BMP-6对RPE细胞无明显的毒性作用，可以轻微促进RPE细胞的增殖。BMP-6可以一定程度上保护视网膜色素上皮受到氧化应激的损伤，但是它的具体作用机制有待进一步的探讨研究，本研究为探讨治疗AMD新方法奠定了一定的基础。

参考文献

1 Gu J，Pauer GJT，Yue X，etal. Assessing susceptibility to age-related macular degeneration with proteomic and genomic biomarkers.MolCell2009;8(6):1338-1349

2 Wankun X，Wenzhen Y，Min Z，etal. Protective effect of paeoniflorin against oxidative stress in human retinal pigment epitheliuminvitro.MolVis2011;17:3512-3522

3 Chen H，Lukas TJ，Du N，etal. Dysfunction of the Retinal Pigment Epithelium with Age:Increased Iron Decreases Phagocytosis and Lysosomal Activity.InvestOphthalmolVisSci2009;50(4):1895-1902

4 Andriopoulos B Jr，Corradini E，Xia Y，etal. BMP6 is a key endogenous regulator of hepcidin expression and iron metabolism.NatGenet2009;41(4):482-487

5 Bhutto I，Lutty G. Understanding age-related macular degeneration (AMD):relationships between the photoreceptor /retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex.MolAspectsMed2012；33(4):295-317

6 Haudek VJ，Gundacker NC，Slany A，etal. Consequences of acute and chronic oxidative stress upon the expression pattern of proteins in peripheral blood mononuclear ceils.JProteomeRes2008；7(12):5138-5147

7 Gnana-Prakasam JP，Martin PM，Smith SB，etal. Expression and Function of Iron-Regulatory Proteins in Retina.IUBMBLife2010;62(5):363-370

8 Chen H，Lukas TJ，Du N，etal. Dysfunction of the retinal pigment epithelium wSith age:increased iron decreases phagocytosis and lysosomal activity.InvestOphthalmolVisSci2009;50(4):1895-1902

9 Wu WK，Sung JJ，Wu YC，etal. Bone morphogenetic protein signaling is required for the anti-mitogenic effect of the Proteasome inhibitor MG-132 on colon cancer cells.BrJPharmaeol2008;154(3):632-638

10 Babitt JL，Huang FW，Xia Y，etal. Modulation of bone morphogenetic protein signalinginvivoregulates systemic iron balance.JCliInvest2007;117(7):1933-1939

11 Haynes T，Gutierrez C，Aycinena JC，etal. BMP signaling mediates stem/progenitor cell-induced retina regeneration.ProcNatlAcadSci2007;104(51):20380-20385

12 Meynard D，Kautz L，Darnaud V，etal. Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload.Natgenet2009;41(4):478-481

13 Hollyfield JG，Bonilha VL，Rayborn ME，etal. Oxidative damage-induced inflammation initiates age-related macular degeneration.NatMed2008；14(2):194-198

14 Hadziahmetovic M, Song Y, Wolkow N,etal. Bmp6 Regulates Retinal Iron Homeostasis and Has Altered Expression in Age-Related Macular Degeneration.AmJPathol2011;179(1):335-348

15 Barnouin K, Dubuisson ML, Child ES,etal. H2O2induces a transient multi-phase cell cycle arrest in mouse fibroblasts through modulating cyclin D and p21Cip1 expression.JBiolChem2002;277(16):13761-13770

16 Chaudhary P, Sharma R, Sahu M,etal. 4-Hydroxynonenal Induces G2/M Phase Cell Cycle Arrest by Activation of the Ataxia Telangiectasia Mutated and Rad3-related Protein (ATR)/Checkpoint Kinase 1 (Chk1) Signaling Pathway.JBiolChem2013；288(28):20532-20546

Li Chen1， Ming Liu2，Yong Liu3， De-Xiu Zhang1

Foundation item:Research and Development Program of Science and Technology of Shaanxi Province of China (No.2012K16-11-01)

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China;2Department of Ophthalmology, Xi’an No.1 Hospital, Xi’an 710001，Shaanxi Province, China;3Institute of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Yong Liu. Institute of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China. liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

Received：2015-07-04Accepted：2015-12-15

Abstract

•AIM:To investigate the effect of bone morphogenetic protein 6(BMP-6) on cellular morphology, proliferation and apoptosis of retinal pigment epithelial cells(ARPE-19) incubated in hydrogen peroxide(H2O2).

•METHODS:ARPE-19 cells were cultured conventionally and divided into four groups. One group was untreated as blank group, the other three groups were incubated in 75μm/L H2O2, 150ng/mLBMP-6 or75μm/L H2O2+150ng/mL BMP-6. All the groups were incubated for 3h, 6h, 9h and 12h. We tested the cell viabilitity by MTT. We used flow cytometry to test the cell cycle and cell apoptosis.

•RESULTS:H2O2significantly decreased the cell activity in time-dependent manner. The activity of cells with BMP-6+H2O2was higher H2O2group, and the differences between the two groups at 3h and 6h were significant (P<0.05). The observation on cellular morphology showed that the cell number decreased and the cell detachment after 6h incubated with H2O2， while the cells with BMP-6 were less cell detachment and apoptosis.

•CONCLUSION:BMP-6 has protective effects on RPE cells from oxidative stress in certain extent.

KEYWORDS:•bone morphogenetic protein 6;oxidative stress；age-related macular degeneration;hydrogen peroxide

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.09

收稿日期：2015-07-04 修回日期： 2015-12-15

通讯作者：刘勇，博士，博士研究生导师，研究方向：脑血管病基础研究与神经干细胞应用基础研究.liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

作者简介：陈丽，女，在读博士研究生，研究方向：视网膜疾病的基础研究。

基金项目：中国陕西省科学技术研究发展计划项目(No.2012K16-11-01)
作者单位：`1(710061)中国陕西省西安市，西安交通大学医学院第一附属医院眼科；`2(710001)中国陕西省西安市第一医院眼科；`3(710061)中国陕西省西安市，西安交通大学医学院神经生物研究所