尼古丁降解菌株HZN7的最佳生长条件及土壤中降解特性

尼古丁降解菌株HZN7的最佳生长条件及土壤中降解特性

马云，洪骏

(浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014)

摘要：利用从杭州农药厂活性污泥中筛选到的一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinella sp.HZN7为对象，通过正交试验对影响菌株生长的pH值、温度、氯化钠、葡萄糖、转速等条件参数进行了优化，得出了其在实验室条件下的最佳生长条件.通过在土壤中添加烟草废弃物，利用该高效尼古丁降解菌株Shinella sp.HZN7对模拟烟草废弃物污染土壤进行生物修复的土壤实验，实验表明：添加菌株的处理组与不加菌株的对照组相比，在尼古丁的去除能力、pH值稳定性、含水率保持等方面均有较大改善，以及对土壤有机质量的变化产生一定的影响，且在一定范围内，随着烟草废弃物添加量的增大，生物修复的效果越明显.

关键词：尼古丁；正交实验；降解；生物修复

收稿日期：2015-03-27

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21007058)；浙江省自然科学基金资助项目(GB13031050069)

作者简介：马云(1977—)，女，浙江杭州人，副教授，博士，研究方向为环境微生物，E-mail:mayun@zjut.edu.cn.

中图分类号：X172

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2015)05-0537-06

Abstract:Taking a strain of bacterium Shinella sp. HZN7 degrading nicotine isolated from the sludge in insecticide factory of Hangzhou as an object, we determined its optimal growth conditions by orthogonal experimental design. The factors are including pH value, temperature, sodium chloride, glucose and the speed of shaking tables. By adding tobacco waste into soil, the soil experiment includes that the bioremediation of the soil contaminating tobacco waste by using the degrading bacterium Shinella sp. HZN7, it indicates that the nicotine removal efficiency was better than the case in which the bacterium Shinella sp. HZN7 was not added. In addition, pH stability with time and the moisture content was improved, the total organic carbon was influenced. The effect of bioremediation was more remarkable with adding more tobacco waste within its limits.

Keywords:nicotine; orthogonal experiment; degradation; bioremediation

Optimal growth conditions and degrading nicotine characteristic

in soil of strain HZN7

MA Yun, HONG Jun

(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

尼古丁，又名烟碱，是一种存在于茄科植物中的生物碱，也是烟草的重要成分[1].由于尼古丁水溶性很大，能通过口、鼻、支气管黏膜被人体迅速吸收，进入人体后能使人上瘾或产生依赖性.重复使用会对心、脑、肺和血管等造成损伤，严重的还会引发肺癌等在内的多种疾病[2].对比于传统的物理、化学处理法，利用微生物降解菌处理环境中的烟碱类污染是一种高效、经济和无二次污染的绿色处理方式[3-5].因此，本研究以从实验室分离得到的一株尼古丁降解菌HZN7为材料，将其生长条件进行优化，并对其在土壤中降解尼古丁的降解特性进行了初步研究，为后续在实际工程应用中利用该菌实现对尼古丁污染土壤的微生物修复提供了理论依据[6].

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌源

菌株HZN7(申氏杆菌属，Shinellasp.)为本实验室分离，保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2013060.

1.1.2培养基

LB培养基(Luria-Bertani medium):含10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L酵母膏和10.0 g/L氯化钠，pH7.0.

1.1.3烟草废弃物

取自杭州利群卷烟厂，120 ℃烘干至恒重，密封.

1.1.4供试土壤

采自浙江工业大学校园内菜地表层土(0～20 cm)，采集土样预处理：多点采样，去除杂物，自然风干，研磨均匀，过1 mm(30目)筛后，室温保存[7].

1.1.5主要仪器设备

电子天平(AC204)，恒温振荡器(THZ-C)，恒温振荡摇床，数显鼓风干燥箱(GZX-9070)，pH计(奥立龙828)，单道移液器(eppendorf),高压蒸汽灭菌锅(ES-315)，紫外可见分光光度计(JASCO V-550型)，高效液相色谱仪(HPLC, JASCO 2000 plus)等.

1.2正交试验

通过比较不同pH值、温度、氯化钠、葡萄糖、转速对菌体生长的影响，从中筛选出菌株HZN7的最佳生长条件，确定影响因子的影响顺序[8-9].依据正交实验设计，以LB培养基为基础，通过改变pH值、温度、转速、添加、减少或者改变培养基中某些组分的质量分数，配制成不同体系的液体培养基.然后按5%的接种量接入在LB培养基中培养至对数期的HZN7(OD600=0.90,菌体用无菌水洗涤2次)，摇床培养12 h.取2 mL菌液，6 000 r/min离心5 min,弃上清液，加入等体积去离子水混匀，稀释至适当浓度后，用紫外可见分光光度计在600 nm波长下测定吸光度[10].

1.3土壤试验

1.3.1土壤的活化预处理

选取浙江工业大学校园内菜地表层土作为供试土壤(经检测不含尼古丁)，将研磨过筛后的土壤分别称取500 g置于2 L的烧杯中，烧杯底部铺一层直径约10 mm碎石子，高度约30 mm，随后在上面铺盖3层网状纱布封垫，将土壤置于纱布之上.在土壤中加入适量无菌水并用玻璃棒不断搅拌使其含水率保持在20%左右，玻璃棒的搅拌不仅使水分均匀分布，还能使土壤疏松，保证足够的O2补给.最后用保鲜膜封住烧杯口，防止表层土壤中的水分迅速挥发，保鲜膜上留有一些小孔，保证与外部空气流通.以上处理过的供试土壤在室温下放置3 d以待土壤的活化，期间用玻璃棒定时搅拌和疏松土壤、添加适量水分保持土壤的含氧量和含水率.

1.3.2烟草废弃物及菌液的添加

在预处理后的土壤中添加烟草废弃物，用搅拌的方式将其混匀.本实验设置5个实验处理组，每组添加的烟草废弃物量依次为25，50，75，100，125 g，每组各设置3个重复.同时设置对照处理组，每组添加跟实验组相同量的烟草废弃物，只是不加尼古丁降解菌，同样每组各设置3个重复.各组实验均在室温条件下进行，并适时补充水分，保持20%左右的土壤含水率.由于烟草废弃物进入土壤中需要一个过程(浸润时间大约2 d左右，预实验结果)，因此，在添加烟草废弃物的第3d开始投加处于生长稳定期(OD600约为1.5)的尼古丁高效降解菌Shinellasp.HZN7，投加比例为5%.实验周期为4周，在每周的第1 d添加一次与首次添加量相等的烟草废弃物，实验组在第3次添加烟草废弃物后的第3 d(即第3周的第3 d)再投加1次相同比例的尼古丁高效降解菌Shinellasp.HZN7.

1.3.3尼古丁残留量、pH值、土壤含水率、有机质量的测定

尼古丁残留量用水溶法测定，每次在不同土层取10 g土样，加入30 mL去离子水，在30 ℃恒温摇床中振荡1 h，静置1 h，6 000 r/min离心10 min(2次)，取上层水溶液过0.45 μm水系滤膜，滤液待液相色谱测定.检测条件为：柱温30 ℃，流动相采用V(甲醇)∶V(水)∶V(浓硫酸)=10∶90∶0.01，流速0.6 mL/min，检测波长254 nm，进样量20 μL.pH值用玻璃电极法测定，供试m(土壤)∶m(水)=1∶5比例混合测定.含水率的测定，每次称取2 g土样，放置于已知重量的可加热器皿中，将器皿放入105 ℃烘箱中，干燥2 h，取出容器冷却后称重，根据干燥前后土壤和器皿总重量的减少量计算出土壤的含水率(%).有机质量采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定(参照HJ615—2011《中华人民共和国国家环境保护标准》)，本法直接测定的是土壤中有机碳的量，根据有机碳换算成有机质系数，将其换算成土壤中有机质的量.以上指标均每隔1 d测定1次.

2结果与分析

2.1菌株HZN7最佳生长条件的正交试验

本实验采用5因素3水平设计(表1)，以L18(35)设计，每一种组合分别设3个重复.根据K值、R值进行统计学分析，K值表示的是同一因素各水平的实验结果之和，k值表示K值的平均值，K值的大小则反映该因素中各水平对实验结果影响的大小.R(极差)为同一因素中kmax-kmin，根据极差的大小可以判断各因素对实验指标的影响主次，R值的大小说明该因素对实验结果影响的大小，R值越大，说明该因素对实验结果影响越大，R值越小则说明该因素的影响越小.

表1　各因素水平列表

表2　L 18(3 5)正交试验结果

注：1)A，B，C，D，E分别代表相应的因素，下标代表其对应的水平.

由表2可知：根据正交试验的结果，菌株HZN7的最佳生长条件pH值为7.0，葡萄糖10 g/L，氯化钠10 g/L，温度40 ℃，转速180 r/min.按上述条件进行实验，摇床培养12 h，菌株HZN7的OD600达到1.517.由此可知，A2B3C2D3E2为菌株的最佳生长条件，且各因素的影响顺序为C>A>B>E>D.

2.2土壤试验

2.2.1不同量烟草废弃物污染下尼古丁的降解

土壤中的尼古丁主要来自于烟草及其废弃物、烟碱型农药、含尼古丁的药剂等[11].由于考虑到现实情况下，工厂附近的含尼古丁的废弃物会以堆砌的方式长期存放于一处，容易造成土壤中尼古丁的残留量呈现复合增加的趋势，因此本试验采用重复添加烟草废弃物的方法，与现实相类似[12].对添加不同量烟草废弃物情况下土壤中尼古丁质量分数的比较，由图1可知：在添加尼古丁高效降解菌株HZN7的情况下，菌株对烟草废弃物污染土壤中的尼古丁的降解具有协助作用，对尼古丁污染土壤显示出了一定的修复能力.与添加菌液的处理组相比，添加烟草废弃物量较少时，如25 g和50 g，土壤本身的自净能力也能将少量的尼古丁降解去除，但添加菌液处理组的尼古丁降解速度明显要高于对照组.

图1　不同添加量下尼古丁降解情况的比较 Fig.1　Comparation of the nicotine degradation with different adding amount

在添加烟草废弃物量较多的情况下，如100 g和125 g，未添加菌液的对照组土壤中尼古丁的降解速度明显低于加菌的处理组.这可能是由于重复且大量添加高污染物的情况下，高浓度的尼古丁对土壤中的土著微生物产生毒性，造成了生理抑制的原因，超出了土壤的自净能力，所以随着时间的推移，土壤中尼古丁的质量分数呈现出累积性.从图1可知：在添加量为100 g的烟草废弃物情况下的尼古丁的降解效果最为理想，土壤中尼古丁残留量始终控制在0.5 g/kg以下，不会产生累积性的污染.

2.2.2不同量烟草废弃物污染下的土壤pH值变化

由于土壤中微生物的活动需要特定的理化环境，可能会对土壤原有的pH值发生改变，因此对土壤pH值的监测，有利于弄清土壤中特定微生物的生存状态.如图2所示，在微生物降解尼古丁的过程中，土壤pH值整体呈上升趋势.在添加烟草废弃物初期，土壤pH值会明显下降，且添加量越多，pH值降低越多，这可能是由于烟草废弃物中含有的一些醇类、脂类物质和不饱和脂肪酸等酸类物质造成的[13].在添加的烟草废弃物量较少的情况下，如25 g和50 g，添加菌液的处理组与对照组相比，pH值在变化趋势、范围上具有较好的一致性，这可能是由于污染物较少，土壤中的降解微生物在还未达到最佳理化条件下，污染物就被降解殆尽.但是，在烟草废弃物添加量较大、高污染的情况下，处理组土壤的pH值要高于对照组，且维持在8.5左右.说明在此pH值条件下最有利于尼古丁降解微生物的生长，此时尼古丁的降解速率可能也是最大.

2.2.3不同量烟草废弃物污染土壤的含水率变化

土壤含水率也是每隔1 d测量1次，虽然烟草废弃物中含有的大量烟叶、烟花、烟根、烟杆，其中的纤维素、木质素等物质对水分的保持具有很大贡献[14]，但随着时间推移，土壤水分会由于挥发以及微生物的活动而消耗许多，因此在整个实验过程的中期(即第3周开始时)补充1次水分，以保持土壤湿度不至于太低，以至于影响微生物的生长.如图3所示，整个实验过程中土壤的含水率始终维持在16%～22%之间，对比各不同烟草废弃物污染程度下的实验组和其对照组，发现两组数据间的差异不是很大,说明尼古丁高效降解菌在降解土壤中尼古丁的过程中对土壤含水率的影响不大.

图2　不同添加量下pH情况的比较 Fig.2　Comparation of the pH with different adding amount

图3　不同添加量下含水率变化情况的比较 Fig.3　Comparation of the moisture content with different adding amount

2.2.4不同量烟草废弃物污染土壤的有机质变化

由于土壤中有机质的质量分数受微生物影响较大，因此对土壤有机质的测定在某种意义上也可以反映微生物的活动情况.如图4所示，在添加烟草废弃物之初，土壤中的有机质质量分数会明显上升，这是由于烟草废弃物中含有大量的有机化合物，如有机酸、生物碱、TSNA等[15-16]，很显然，土壤中有机质质量分数与添加的烟草废弃物的量呈正相关.虽然菌株HZN7和土壤中的土著微生物对烟草废弃物中的有机化合物有代谢作用，但随着大量重复的添加烟草废弃物，超出了菌株HZN7和土壤中的土著微生物的承受能力，而且烟草废弃物中的某些组分对微生物有毒害作用[17-18]，导致土壤有机质总量在循环累积增加.对比观察土壤中尼古丁质量分数变化和土壤有机质质量分数的变化，发现两者的变化曲线有一定的关联性，差别在于有机质的降解程度没有尼古丁彻底，原因可能是烟草废弃物中的有机化合物成份的复杂性、多样性，导致土壤中的土著微生物对有机质的降解速度低于有机质加入的速度，而导致有机质积累.

图4　不同添加量下土壤中有机质变化情况的比较 Fig.4　Comparation of the TOC in soil with different adding amount

3结论

本研究对菌株HZN7的生长条件进行了优化，菌株HZN7在优化后的培养基中(葡萄糖10 g/L，氯化钠10 g/L，pH控制7.0)，置于40 ℃，180 r/min的恒温摇床中培养12 h，菌体生长量达到最大，OD600达到1.517.该实验结果为后期在工业上大量生产高效尼古丁降解菌HZN7提供了一定的指导性作用.尼古丁高效降解菌在土壤中降解烟草废弃物的实验表明：在不同量烟草废弃物污染程度下，添加菌株HZN7的处理组与不添加菌株的对照组，尼古丁的去除率得到明显提升，且烟草废弃物添加量在100 g时，对于尼古丁的去除，土壤的修复效果最佳.同时添加了高效降解菌HZN7的土壤，对于维持土壤pH值、含水率、改变微生物的群落结构起到了积极的作用，为后续对于烟草废弃物污染的土壤的修复，做出了一定的理论贡献.

参考文献：

[1]BENOWITZ N L. Nicotine addiction[J]. New England Journal of Medicine,2010,362(24):2295-2303.

[2]HAWKINS B T, ABBRUSCATO T J, EGLETON R D, et al. Nicotine increases in vivo blood-brain barrier permeability and alters cerebral microvascular tight junction protein distribution[J]. Brain Research,2004,1027(1):48-58.

[3]BRENNER K, PANCHWAGH A, RANGRASS S, et al.Biomethanation of tobacco waste[J]. Environmental Pollution,1995,90(2):199-202.

[4]BRANDSCH R. Microbiology and biochemistry of nicotine degradation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,69(5):493-498.

[5]WADA E, YAMASAKI K. Mechanism of microbial degradation of nicotine[J]. Science,1953,117：152-153.

[6]赵巍巍，边拯民，高鹤南，等.烟嘧磺隆降解菌最佳生长条件及其在土壤中的降解特性[J].农药，2010，49(1):41-43.

[7]WANG Xin , TANG Lu , YAO Yanlai , et al. Bioremediation of the tobacco waste-contaminated soil byPseudomonassp. HF-1:nicotine degradation and microbial community analysis[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2013,97:6077-6088.

[8]张小华，张国顺，武俊，等.敌敌畏降解菌(DDV-1)最佳生长条件的正交实验及其在土壤中的降解特性研究[J].土壤通报，2005，36(5)：731-734.

[9]石炳兴，赵红，刘喜朋，等.抗生素AGPM摇瓶发酵条件的正交试验[J].过程工程学报，2001，4(1)：442-444.

[10]马云，刘学虎，洪骏.双酚A降解菌的分离鉴定和降解特性研究[J].浙江工业大学报，2014，42(2)：162-166.

[11]BEKETOV M A, LIESS M.Actue and delayed effects of the neonicotinoid insecticide thiacloprid on seven freshwater arthropods[J]. Environmental Toxicology and Chemistry,2008,27(2):461-470.

[12]王欣.Pseudomonassp. HF-1响应尼古丁胁迫的代谢组学分析及其降解机制与污染修复[D].杭州：浙江大学，2012.

[13]WANG M, YANG G, MIN H, et al. A novel nicotine catabolic plasmid PMH1 inPseudomonassp. strain HF-1[J]. Can Journal Microbiol,2009,55(3):228-233.

[14]BARRETT R E. Tobacco aging, enzymes of bright and burley tobaccos[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1957,5(3):220-224.

[15]WANG S N, XU P, TANG H Z, et al. Biodegradation and detoxification of nicotine in tobacco solid waste by aPseudomonassp[J]. Biotechnology Letters，2004,26(19):1493-1496.

[16]ZHENG K L, YU D M. A status of the comprehensive utilization of discarded tobacco leave[J]. Journal of Chongqing University,2004(3):61-64.

[17]HOCHSTEIN L, RITTENBERG S C. The bacterial oxidation of nicotine oxidation by cell-free preparations[J]. Journal of Biological Chemistry,1959,234(1):151-155.

[18]BATHAM H. Nitrification in soils:Ⅱ[J].Soil Science,1927,24(3):187-204.

(责任编辑：刘岩)

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