液相色谱-串联质谱法测定地高辛及其室间质量评价

孙贺伟，　刘海明，　李水军，　余　琛，　朱建民

[1. 上海大学生命科学学院，上海 200444；

2. 上海市徐汇区中心医院(中国科学院上海临床研究中心)中心实验室，上海 200031]

液相色谱-串联质谱法测定地高辛及其室间质量评价

孙贺伟1，刘海明2，李水军2，余琛2，朱建民2

[1. 上海大学生命科学学院，上海 200444；

2. 上海市徐汇区中心医院(中国科学院上海临床研究中心)中心实验室，上海 200031]

摘要：目的建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测血清地高辛的方法，用于临床开展地高辛治疗药物监测(TDM)。方法采用同位素稀释LC-MS/MS测定血清地高辛浓度并进行方法学评价。样品采用特丁基甲醚提取，反相色谱分离，正离子电喷雾质谱仪检测。分析参加卫生部临检中心地高辛TDM室间质量评价(EQA)的结果，并与电化学发光法进行初步比较。结果LC-MS/MS的线性范围为0.05～5.00 ng/mL，精密度为1.0%～4.3%，准确度为101.3%～108.9%，回收率为95.8%～97.5%，基质效应为95.7%～97.6%。单份样品的分析检测时间为 3 min。血清样品反复冻融3次、放置室温24 h、处理后放置自动进样器36 h的稳定性良好。EQA样品的LC-MS/MS测定结果与靶值的偏差为-4.09%，线性方程为YLC-MS/MS=1.01XEQA靶值-0.09，r=0.99。电化学发光法测定结果比LC-MS/MS平均高36.9%。结论LC-MS/MS测定血清地高辛简便、特异。测定结果符合全国室间质量评价要求，但与电化学发光法存在较大的差异。

关键词：地高辛；液相色谱-串联质谱法；室间质量评价；电化学发光法

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of serum digoxin and its external quality assessmentSUNHewei1，LIUHaiming2，LIShuijun2，YUChen2，ZHUJianmin2

.[1.BiologicalCollege，ShanghaiUniversity，Shanghai200444，China; 2.CentralLaboratory，ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter，ChineseAcademyofSciences)，Shanghai200031，China]

Abstract：ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)for therapeutic drug monitoring(TDM)of serum digoxin. MethodsAn isotope dilution LC-MS/MS was realized by tert-butyl methyl ether extraction， reversed-phase separation and positive electrospray ionization mass spectrometry detection. The results of external quality assessment(EQA)of digoxin TDM program of the National Center for Clinical Laboratory by LC-MS/MS were analyzed and compared with those of electrochemiluminescence immunoassay. ResultsThe linear range was 0.05-5.00 ng/mL. The precision was 1.0%-4.3%, and the accuracy was 101.3%-108.9%. The recovery rate was 95.8%-97.5%, and the matrix effect was 95.7%-97.6%. The total run time was 3 min per injection. Good stability was observed on serum undergoing 3 cycles of frozen-thaw， at room temperature for 24 h and pretreating serum placed in autosampler for 36 h. The average bias was -4.09% between LC-MS/MS and the target value of EQA with a correlation formula of YLC-MS/MS=1.01Xtarget value-0.09， r=0.99. Electrochemiluminescence immunoassay results were 36.9% higher on average than those of LC-MS/MS. ConclusionsLC-MS/MS is simple and specific for the determination of serum digoxin. The results reported by LC-MS/MS are comparable with the national external quality assessment proficiency test. There is significant difference in digoxin results between LC-MS/MS and electrochemiluminescence immunoassay.

Key words：Digoxin; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; External quality assessment; Electrochemiluminescence immunoassay

地高辛是临床抗心力衰竭的常用药物，但其毒副作用大，安全范围窄，药物代谢动力学、药物效应动力学个体差异大，且治疗剂量与中毒剂量相互重叠，易发生中毒反应[1-2]。因此地高辛的血药浓度监测对临床具有重要意义[3]。目前临床上地高辛血药浓度检测多采用基于抗体抗原相结合的免疫学方法，包括化学发光免疫法[4]、放射免疫法[5]、均相免疫法[6]、干化学法[7]等。有研究显示内源性地高辛免疫活性类物质可与免疫试剂盒中的地高辛抗体结合，从而干扰地高辛血药浓度测定[8]。一些外源性物质如螺内酯、卡马西平代谢物、三环类抗抑郁药代谢物以及一些中药如蟾酥、人参、丹参等也能干扰免疫测定法，影响其结果的准确性[8-9]。因此，建立一个特异性高、抗干扰能力强的地高辛检测方法用于临床常规治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)十分有必要。

液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)将液相色谱的高效分离能力和质谱的高特异性检测能力进行了有机结合，在特异性、灵敏度和抗干扰能力方面较其他方法具有明显优势，因此在临床诊断中发挥着越来越重要的作用[10]。在已有研究[11]的基础上，我们对LC-MS/MS测定血清地高辛浓度进行了全面的方法学验证，并分析了连续多年参加卫生部临床检验中心TDM室间质量评价(externalqualityassessment,EQA)的结果。

材料和方法

一、仪器与试剂

1. 仪器5500 QTRP串联质谱仪(美国Applied Biosystems公司)，液相色谱系统(日本Shimadzu公司)由LC-20AD输液泵、DGU-20A3在线脱气仪、SIL-HTc自动进样器组成。Vortex-2型涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)，Mikro 22R冷冻高速离心机(德国Hettich公司)，GR-150型氮吹仪(Techne公司)。 Centaur电化学发光免疫分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics公司，用于临床常规测定地高辛)。

2. 试剂地高辛标准品(纯度98%)购自中国药品生物制品检定所；地高辛-d3(同位素丰度98%)购自加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲酸(液相色谱纯)购自美国Tedia公司；乙酸铵(ACS纯)、乙腈(液相色谱纯)、甲醇(液相色谱纯)购自德国Merck KGaA公司。实验用水为本实验室采用Millipore纯水系统自制。

二、LC-MS/MS分析条件

1. 色谱分析条件分析柱为Capcell C18 MG Ⅲ(5 μm，2.1 mm×100 mm，日本资生堂精细化学公司)；流动相为10 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液(60∶40，v/v)，等度洗脱，流速为0.3 mL/min，进样体积20 μL。

2. 质谱分析条件电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子源，正离子模式。喷雾气：50，辅助加热气：50，气帘气：20，碰撞气：中等。离子源电压：5 500 V，离子源温度：400℃；多反应监测扫描分析，地高辛离子通道分别选择为798.6/651.5 amu(定量)和798.6/233.2 amu(定性)；内标地高辛-d3选择801.6/654.5 amu。

3. 样品处理方法200 μL血清加20 μL内标工作液(10 ng/mL地高辛-d3)，再加1 mL特丁基甲醚涡旋振荡5 min，然后14 000×g离心5 min，取上清液，45℃吹干，加100 μL 40%甲醇重组，涡旋5 min，取80 μL转移至进样瓶供进样分析。

4. 贮备液及工作液配制方法地高辛和同位素内标地高辛-d3均用甲醇配成100 μg/mL，地高辛-d3用40%甲醇稀释至10 ng/mL作为内标工作液，贮备液及工作液4℃保存。在空白小牛血清中加入地高辛贮备液，配制成浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的溶液(用于标准曲线制作)和0.15、4.00 ng/mL的溶液(质控品)，按样品处理方法处理后进样。

三、方法学评价

LC-MS/MS的性能评价指标包括方法特异性、线性范围和检测灵敏度、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性。

1. 特异性观察不同来源的血清对地高辛的干扰情况。取6份不同个体的空白血清，分别配制成浓度为0.15和4.00 ng/mL的地高辛质控品，按样品处理步骤操作并进样分析。

2. 定量限对定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)的要求是准确度为80%～120%、精密度[变异系数(CV)]≤20%、信噪比(signal-noiseratio,S/N)≥10[12]。

3. 精密度和准确度在空白血清中分别配制浓度为0.15和4.00 ng/mL的地高辛质控品，重复测定20次；再测定6批，每批重复测定3次，计算批内、批间精密度与准确度；同时观察地高辛在最低定量限(0.05 ng/mL)处的批内精密度和准确度。

4. 回收率和基质效应取浓度为0.15和4.00 ng/mL的质控品和空白血清各6份，按样品处理方法进行处理，在处理后的空白血清上清液中加入相应浓度的地高辛和地高辛-d3，进样分析，计算质控品与空白添加相应浓度样品的峰面积百分比，即为样品处理过程的回收率。另将空白样品提取后添加相应浓度样品，进样检测，并与空白溶剂添加相应浓度样品的检测结果进行比较，计算相应浓度的峰面积百分比，即为基质效应。

5. 稳定性稳定性可能对检测结果的可靠性、可重复性产生影响，因此有必要对影响稳定性的各种因素(如样品采集、处理、保存等)进行观察，确保在不影响地高辛稳定性的条件下进行操作[13]。将血清样品反复冻融[从-20℃到室温(23℃)解冻3次]、在室温放置24 h以及样品处理后在自动进样器放置36 h后采用LC-MS/MS测定地高辛浓度，并与初始值比较，观察其稳性性。

四、方法比较及室间质量评价

本实验室从2009年下半年开始连续参加卫生部临床检验中心全国TDMEQA计划。该计划1年2次，每次提供5个血清样品。在规定时间内将测定结果上报，卫生部临检中心反馈每次检测的统计结果。由参与TDM EQA计划的临床实验室(2014年为127个实验室)按方法学分组的检测均值确定EQA样品的靶值。测定结果在靶值的20%内视为可接受。

将临床收集的60例血清样品同时采用LC-MS/MS和电化学发光法测定，比较两种方法间的差异。

五、统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。两种方法之间的差异采用配对t检验，方法相关性采用线性回归分析，正态分布检验采用单样本K-S分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、LC-MS/MS测定地高辛方法的建立

以乙酸铵溶液为流动相，地高辛的相对分子质量为780.95 g/mol。在正离子ESI离子化模式下，m/z 798.6 的[M+NH4]+离子信号在乙酸铵溶液体系更加容易形成信号更强的分子离子峰，而过高浓度(>20 mmol/L)乙酸铵则容易抑制离子信号。对分子离子峰碎裂进行二级质谱分析，主要形成m/z 651.5、m/z 233.2和m/z 175.4等碎片离子峰。选择Q1/Q3离子通道798.6/651.5 amu作为定量离子通道，同时选择Q1/Q3离子通道798.6/233.2 amu作为定性离子通道。内标地高辛-d3的质谱特征与地高辛相似，形成m/z 801.5的分子离子峰，碎裂后的二级质谱主要形成m/z 654.5的碎片离子。

采用10 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，地高辛的典型保留时间为1.3 min，总的色谱分析时间为3 min，在空白血清样品中未见对地高辛和内标有干扰的色谱峰，其色谱图见图1。

二、方法学评价

收集临床未服用地高辛的患者血清样品，按照样品处理方法处理后进样分析。在地高辛及内标通道均未发现干扰峰存在，见图1。

取小牛血清配制1 ng/mL地高辛浓度，分别与6个临床血清样品(服用地高辛患者血清，男女各半)等体积混合，重复6次，同时测定临床血清样品、小牛血清、混合样品的地高辛及内标响应。混合样品地高辛/内标比值与理论值(临床血清样品与小牛血清响应均值)的百分比为96.4%±5.1%，说明小牛血清作为空白基质与人血清有良好的互换性。

注：(a)空白样品；(b)LLOQ，地高辛浓度为0.05 ng/mL，S/N=39.5；(c)患者血清样品，地高辛浓度为0.425 ng/mL；地高辛(左图)和内标(右图)的色谱保留时间为1.3 min

图1地高辛典型色谱图

以地高辛添加浓度为X轴，地高辛与内标的峰面积比为Y轴，进行线性回归，经“1/X”权重得回归方程为Y=0.075 5X+0.013 1，r=0.999 7。表明地高辛在0.05～5 ng/mL血清浓度范围内线性关系良好。本方法的LLOQ为0.05 ng/mL，S/N为39.5，见图1。检测限可达0.005 ng/mL。

本方法的精密度≤4.3%，准确度为101.3%～108.9%,回收率为95.8%～97.5%，基质效应为95.7%～97.6%。见表1。

表1　地高辛准确度和精密度

血清样品经反复冻融(从-20℃到室温反复解冻3次)、室温放置24 h、样品处理后在自动进样器(室温)放置36 h后的地高辛测定结果与初始测定值比较，偏差均在允许范围内，见表2。

表2　稳定性结果

三、EQA及方法比较

采用本实验室自建的LC-MS/MS测定EQA样品中的地高辛浓度，将测定结果与靶值进行线性回归分析，见图2。回归方程为YLC-MS/MS=1.01XEQA靶值-0.09，r=0.99，与靶值的平均偏差为-4.09%(n=55)，偏差(均值±2s)为-20.7%～12.5%。LC-MS/MS结果和EQA靶值在低浓度时存在负偏差。

采用LC-MS/MS和电化学发光法测定60例临床血清样品中的地高辛浓度，结果见图3。

注：(a)线性回归图，YLC-MS/MS=1.01X靶值-0.09，r=0.99；(b)Bland-Altman图，LC-MS/MS测定结果与靶值的平均偏差为-4.09%，偏差(均值±2s)为-20.7%～12.5%

图2LC-MS/MS测定结果与靶值之间的线性回归图和Bland-Altman图

图3　LC-MS/MS和电化学发光法测定血清地高辛的比较

单样本K-S分析显示2组数据均呈正态分布，因此采用配对t检验分析两组均值的差异。LC-MS/MS测定结果为(0.78±0.45)ng/mL，电化学发光法结果为(1.03±0.55)ng/mL，两种方法之间差异有统计学意义(P<0.01)。电化学发光法测定结果比LC-MS/MS平均高36.9%。

讨论

地高辛治疗指数低，安全范围窄，药动学、药效学个体差异大，肝肾功能不全等可引起中毒反应。因此临床上需进行TDM，分析血药浓度与临床治疗效果及中毒反应的关联性[3]。传统的地高辛治疗范围(血清浓度)为0.8～2.0 ng/mL，这个浓度范围主要是用于判别地高辛中毒，其有效性范围一致存在争议[14]。

目前临床上应用于地高辛血药浓度监测的方法主要是基于免疫学原理，采用抗原与抗体特异性反应形成抗原-抗体免疫复合物。免疫法无法直接检测地高辛本身，其底物检测必须依赖一系列的免疫反应，经常容易受到内外源性地高辛免疫活性物质的干扰[15]，这些检测结果可能会带给临床错误甚至危险的诊断。

在原有的工作[11]基础上，本研究采用LC-MS/MS检测血清地高辛浓度，调整了线性浓度范围，同时开展了EQA的持续评价，并与电化学发光法进行了初步比对。结果表明，不同来源的血清对测定结果的影响基本一致，LC-MS/MS具有较好的特异性；LLOQ为0.05 ng/mL，具有非常高的灵敏度；线性范围为0.05～5.0 ng/mL，足以覆盖地高辛在临床上可能出现的各种浓度范围。

LC-MS/MS与EQA靶值的比对结果显示两者的相关性良好，平均偏差为-4.09%，具有较好的可比性。由此可见，LC-MS/MS不但可为地高辛的临床TDM提供服务，同时亦可为临床TDM建立质控方法。LC-MS/MS与电化学发光法的比对结果显示二者之间结果差异很大，电化学发光法结果明显高于LC-MS/MS，特别是在低浓度时差异尤为明显，具体原因需要今后与参考方法比较及进行相关干扰研究得到确切结论。如因检测方法的原因导致地高辛检测结果偏高，那么在临床上可能会造成部分接受地高辛治疗的患者血清浓度尚未到达合适的治疗范围，而检测结果则指示临床无需调整治疗剂量的错误后果。由此可见，需要进一步开展有关地高辛检测方法的干扰研究、参考方法建立、室间质量控制甚至正确度验证等工作，切实提高地高辛检测的质量，促进地高辛TDM的临床效果。

综上所述，今后可将LC-MS/MS作为临床地高辛TDM的质控方法。在相关部门的管理下，各个医院实验室应积极开展地高辛TDM的EQA，采用统一的、标准的地高辛TDM质控品来改善实验室之间、方法之间以及方法内的偏差，以便为临床诊断提供更好的服务。

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(本文编辑：龚晓霖)

注： 焦瑞宝与唐吉斌对本研究具有同等贡献，并列为第一作者。

收稿日期：(2015-01-23)

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)05-0437-05R446.1

文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.007

通讯作者：李水军，联系电话：021-54031835。

作者简介：孙贺伟，男，1991年生，学士，主要从事质谱技术生物分析工作。

基金项目：上海市药学会科研基金资助项目(2014-YY-02-19)