大豆品种科丰14及其突变系的鉴定

张凯淅， 韩 俊， 王 程， 郭 蓓， 谢 皓

（北京农学院植物科学技术学院， 北京102206）

北农106、北农107和北农108是北京农学院大豆研究室以大豆品种科丰14为辐照亲本，利用60Co－γ射线辐照其干种子，从1株持绿型突变体中经系谱法选育而成的姊妹系，均具有叶片、果荚失绿延迟，成熟后种子为绿种皮和绿子叶等特征［1］。其中，北农106、北农107和北农108于2012年申报了品种权保护，北农106于2014年通过北京市农作物品种审定委员会审定。由于北农106、北农107和北农108来自同一亲本科丰14，农艺性状十分相似，因此，在品种的鉴别上有一定难度。

分子标记技术的发展，为品种鉴定提供了新的途径。SSR标记是目前品种鉴定上常用的技术，已在很多农作 物 上 应 用，例 如，大 豆［2］、玉 米［3］、水 稻［4］、棉花［5］、小麦［6］、洋葱［7］等。本试验利用传统的植物形态性状鉴定方法与SSR标记技术相结合，对科丰14及其突变系北农106、北农107和北农108进行鉴定，旨在为北农106、北农107和北农108种子的鉴别与品种权保护供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

科丰14、北农106、北农107和北农108的种子由北京农学院大豆研究室提供。

8 30对大豆SSR引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，试验药品购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 形态性状鉴定

科丰14、北农106、北农107和北农108的种子夏播，种植于北京农学院试验田。每品种1小区，每小区3行，行长5m，株距0.1m。生长期间记载生育期、花色、叶形、生长习性等性状，成熟后每品种随机收获20株，调查植株和籽粒性状。

1.2.2 SSR分子标记鉴定

大豆幼苗期，每品种随机取10株幼嫩叶片，分别提取基因组DNA，等量DNA混合为品种SSR标记的DNA模版。DNA的提取采用CTAB法，PCR扩增采用10μL反应体系，8%聚丙烯酰胺非变性胶电泳，1%硝酸银水溶液银染，制干胶保存，根据标记的多态性统计结果。

2 结果与分析

2.1 科丰14及其突变系主要生物学性状比较

北农106、北农107和北农108为姊妹系，来自于同一个辐照亲本科丰14，因此，大部分生物学性状与科丰14相同，但是，也有部分性状有别于科丰14（表1）。例如，科丰14成熟后叶片变黄，籽粒呈黄种皮、黄子叶特征，北农106、北农107和北农108在成熟期具有持绿特点，种皮和子叶均为绿色。由于持绿，北农106、北农107和北农108的生育期普遍延长，同样的栽培条件下，植株的高度也有差异，百粒重也不尽相同。

在北农106、北农107和北农108姊妹系之间，除生育期、百粒重有差异外，植株的花色和种脐颜色也有变化。北农106和北农107为紫花，而北农108为白花与科丰14相同；北农106为褐色种脐，而北农107和北农108为浅褐色种脐与科丰14相同。这些性状的差别，为北农106、北农107和北农108以及科丰14的鉴定与鉴别提供了依据。但是，在种子阶段，北农106、北农107和北农108之间因籽粒颜色、粒型相同，难以鉴别。此外，虽然科丰14为黄种皮、黄子叶，但在苗期阶段与其突变系之间也存在差别不明显、容易混淆的问题。因此，建立分子水平的鉴定方法十分必要。

表1 北农106、北农107、北农108和科丰14主要生物学性状的比较

2.2 科丰14及其突变系SSR标记的多态性分析

为在分子水平鉴定科丰14及其突变系，采用SSR分子标记技术进行了多态性分析，试图挖掘不同品种间特异的SSR标记，作为鉴定依据。经利用分布在大豆遗传图谱上的830对SSR引物，对科丰14和其突变系北农106、北农107、北农108的基因组DNA进行PCR反应和产生的标记位点分析。分别发现科丰14有7对SSR引物产生的标记位点与北农106、北农107和北农108表现多态性；北农106有3对引物产生的标记位点与北农107、北农108和科丰14表现多态性；北农107有2对引物产生的标记位点与北农106、北农108和科丰14表现多态性；北农108有2对引物产生的标记位点与北农106、北农107和科丰14表现多态性。

图1 科丰14与北农106、北农107和北农108DNA SSR扩增产物多态性图谱

2.2.1 科丰14与北农106、北农107和北农108之间的多态性分析

对在科丰14与北农106、北农107和北农108之间有多态性扩增的7对SSR引物多次检测，结果表明，Satt 228、Sat＿160、Sat＿227、Sat＿362、Satt 514、Sat＿381和Satt 213共7对引物对科丰14扩增的产物分子量大小有别于对北农106、北农107和北农108产生的分子量（图1），其分别产生的特异带型Satt228＿170bp、Sat＿160＿90bp、Sat＿227＿150bp、Sat＿362＿120bp、Satt514＿150bp、Sat＿381＿200bp和Satt213＿80bp能够在分子水平上从科丰14、北农106、北农107和北农108这4个品种中鉴别出科丰14。因此，上述7个引物所产生的带型，可作为鉴定科丰14的分子标记。

2.2.2 北农106与北农107、科丰14和北农108之间的多态性分析

对在北农106与北农107、北农108和科丰14之间有多态性扩增的 Satt 204、Sat＿380和Satt 706共3对SSR引物多次检测，结果表明，这3个引物能够分别扩增出不同于北农107、北农108和科丰14的特异带型（图2），其标记Satt204＿105bp、Sat＿380＿150bp和 Satt706＿160bp，可以作为鉴定北农106分子标记。

2.2.3 北农107与科丰14、北农106和北农108之间的多态性分析

利用BE 475343和Sat＿211引物对北农107与北农106、北农108和科丰14的DNA多次扩增，结果表明，分别产

生的分子标记BE475343＿100bp和Sat＿211＿110bp具有北农107的特异性（图3），可分别作为北农107的鉴定标记。

2.2.4 北农108与科丰14、北农106和北农107之间的多态性分析

同理，经多次重复检测，Satt 367和Satt 373引物在北农108的DNA中产生的Satt367＿130bp和Satt373＿160bp标记（图4），为北农108的特异标记，可作为鉴别北农108的SSR分子标记。

2.3 SSR标记在大豆连锁群位点的分析

通过对830对SSR引物的筛选，发现14对引物能够在科丰14、北农106、北农107和北农108的DNA中扩增出多态性。由于北农106、北农107和北农108为突变姊妹系，衍生于辐照亲本科丰14，因此，通过对连锁图谱上SSR位点的分析，能够进一步推断亲子间、姊妹间发生变异位点的多寡与染色体的位置。表2是利用 NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）检索，获得的上述14对引物在大豆连锁群上的位置。从表2可以看出，在大豆20个连锁群中，科丰14与突变系之间产生的7个位点的SSR标记，涉及5个连锁群，表明60Co－γ射线辐照科丰14后，至少在5条染色体的DNA序列发生了变异，导致北农106等突变系的产生；突变系北农106与北农107、北农108之间有3个位点特异标记，涉及1个连锁群，表明北农106至少有1条染色体DNA序列与北农107、北农108的序列有差异；同理，北农107与北农106、北农108之间至少有1条染色体DNA序列不同；北农108与北农106、北农107之间至少有2条染色体DNA序列有别。

表2 SSR引物标记位点在大豆连锁群上的位置

图2 北农106与北农107、北农108和科丰14DNA SSR扩增产物多态性图谱

图3 北农107与、北农106北农108和科丰14DNA SSR扩增产物多态性图谱

注：A和B分别表示SSR引物Satt 367和Satt 373。

3 讨 论

辐照诱变是创制大豆新种质的重要手段之一，本试验供试材料中的北农106等突变系就是利用60Co－γ射线辐照诱变获得，与其辐照亲本科丰14相比，有部分生物学性状发生了变化，例如，种皮颜色、子叶颜色、成熟期持绿型及全生育期天数等，这些性状可以作为鉴别科丰14和北农106等突变系的形态标记。同时，由于科丰14辐照后变异幅度较大，导致形成北农106等突变系之间的部分性状也不相同，可以利用品系间的性状差异加以鉴别，例如，北农106生育期105d，株高60cm，紫花，种脐褐色；北农107生育期120d，株高75cm，紫花，种脐浅褐色；北农115生育期120d，株高80cm，白花，种脐褐色。

利用分子标记对品种进行真实性鉴定，具有较高的准确性和稳定性。因此，本试验尝试应用大豆SSR标记对科丰14及其突变系进行鉴定。结果发现，科丰14有7个SSR标记可用来区别突变系的种子；北农106有3个SSR标记可与北农107、北农108鉴别；北农107有2个SSR标记可以与北农106、北农108鉴别；北农108有2个SSR标记可与北农106、北农107鉴别。上述SSR标记能够用来鉴定科丰14及其突变系等品种。

据陈静等报道，60Co－γ射线辐照诱变可使得DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异，呈现多个位点突变［8］。本试验发现的科丰14和突变系间的多个SSR标记位点，验证了上述结论，例如，科丰14有4个特异标记分别来自2条染色体，北农106的3个标记来自于1条染色体，北农107的2个标记也来自于1条染色体，特别是科丰14与其突变系特异的标记中，有2个标记来自同一染色体，但是位点相对距离较远（E－3.72，E－64.18），说明科丰14被辐射后，导致多条染色体DNA的多个区段发生了变异，进而产生了新的突变体。

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