新型甾体N，N-二甲基缩氨硫腙类化合物的合成及其抗肿瘤活性*

黄燕敏，郑嘉桦，赵丹丹，戚斌斌，杨春晖，盛海兵，甘春芳，崔建国(广西师范学院化学与材料科学学院，广西南宁　530001)



新型甾体N，N-二甲基缩氨硫腙类化合物的合成及其抗肿瘤活性*

黄燕敏，郑嘉桦，赵丹丹，戚斌斌，杨春晖，盛海兵，甘春芳，崔建国
(广西师范学院化学与材料科学学院，广西南宁530001)

摘要:以乙醇(或甲醇为溶剂)，冰醋酸为催化剂，去氢表雄酮、孕烯醇酮、雌酮和3，5-二羟基-6-甲酰基-B-降胆甾烷分别与N，N-二甲基硫代氨基脲经缩合反应，合成了4个新型的具有不同甾核结构特征的甾体N，N-二甲基缩氨硫腙类化合物(1～4)，其结构经1H NMR，13C NMR，IR和HR-EI-MS表征。采用MTT法测定了1～4对肝癌细胞(HepG)、人鼻咽癌细胞(CNE-2)和人肾上皮细胞(HEK-293T)的体外抑制细胞生长增殖活性。结果表明:1～3对HepG和CNE-2具有明显的抑制活性。

关键词:甾酮; 3，5-二羟基-6-甲酰基-B-降胆甾烷; N，N-二甲基甾体缩氨硫腙;合成;抗肿瘤活性

Tel.0771-3101180，E-mail:huangyanmin828@163.com

通信联系人:崔建国，教授，Tel.0771-5530019，E-mail:cuijg1954@126.com

近来，人们发现在甾体化合物中引入氮，硫原子或与含氮，硫等杂原子的药效基团拼合后，会产生独特的生物活性，用于治疗不同的疾病［1－6］。腙类化合物是有机化学家关注的焦点［7－8］，许多结构独特的甾体腙类化合物已相继被合成，并且许多具有良好的抗肿瘤、抗菌及抗病毒活性［9－11］。其中，缩胺硫腙化合物因其良好的肿瘤细胞毒性、抗菌活性及抗病毒活性，日益受到药物学家关注。在甾体中引入缩胺硫腙药效团的化合物有很好的镇痛、抗菌、抗真菌及抗炎活性［12－16］。但至今为止，具有抗肿瘤活性的甾体缩胺硫腙化合物报道较少。

Scheme 1

本课题组曾分别以胆固醇、孕烯醇酮、豆甾醇等为原料，合成了一系列甾体肟类及缩氨硫腙类化合物。体外抗肿瘤活性研究发现其有较好的抑制肿瘤细胞生长增殖活性［17－20］。2010年，Huang H等［21］设计并合成了一系列结构新颖的稠环类缩胺硫腙化合物，并深入研究了其抗肿瘤活性和作用机制。其中部分化合物表现出显著抑制人肿瘤细胞生长增殖活性，特别是具有N，N-二甲基缩氨硫腙结构的化合物TSC24(Chart 1)活性最强，对不同肿瘤细胞株抑制活性的IC50值在2 μmol· L－1～830 μmol·L－1

Chart 1

受此启发，本文在文献［21］方法的基础上，以乙醇(或甲醇为溶剂)，冰醋酸为催化剂，去氢表雄酮、孕烯醇酮、雌酮和3，5-二羟基-6-甲酰基-B-降胆甾烷分别与N，N-二甲基硫代氨基脲经缩合反应，合成了4个新型的具有不同甾核结构特征的甾体N，N-二甲基缩氨硫腙化合物(1～4，Scheme 1)，其结构经1H NMR，13C NMR，IR和HR-EI-MS确证。测定了1～4对肿瘤细胞［肝癌细胞(HepG)、人鼻咽癌细胞(CNE-2)和人肾上皮细胞(HEK-293T)］的生长增殖活性，希望利用甾体化合物渗透细胞膜的功能，获得具有更好抗肿瘤活性的甾体缩氨硫腙化合物。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

X6型显微熔点仪(温度未校正); Bruker AV-300型超导核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标); Thermo Scientific Nicolet IS-10型傅立叶红外光谱仪(KBr压片); Agilent 6210 TOFMS型质谱仪; MLLTISKAN MK3型分光光度仪。

3，5-二羟基-6-甲酰基-B-降胆甾烷参考文献［19］方法合成;去氢表雄酮、孕烯醇酮，雌酮和N，N-二甲基硫代氨基脲，百灵威科技有限公司;薄层层析板和硅胶，安徽良臣硅源材料有限公司;其余所用试剂均为分析纯，溶剂按常规方法干燥除水。

1.2 1～4的合成通法

在反应瓶中加入甾醇0.40 mmol，N，N-二甲基氨基硫脲0.41 mmol和无水乙醇25 mL，于75℃搅拌使其完全溶解;加入冰醋酸0.5 mL，反应4 h(TLC跟踪)。减压蒸除大部分溶剂后加入蒸馏水20 mL，用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液(30 mL)和饱和氯化钠溶液(30 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥;减压蒸除溶剂后经柱层析［洗脱剂:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1］纯化得白色固体1～3和棕色油状液体4。

N，N-二甲基-去氢表雄酮-17-缩氨硫腙(1):产率32%，m.p.200℃～202℃;1H NMR δ:0.92(s，3H，18-H)，1.04(s，3H，19-H)，3.33(s，6H，NCH3)，3.48～3.59(m，1H，3-Hα)，5.37(d，J=4.8 Hz，1H，6-H)，7.87(br s，1H，NH);13C NMR δ:16.8(C18)，19.4(C19)，20.5(C11)，23.5(C15)，29.7(C16)，31.2(C8)，31.3(C7)，31.6(C2)，33.9(C12)，34.0(C10)，36.6(NCH3)，37.2(C1)，42.2(C4)，44.5(C13)，50.3(C9)，53.8(C14)，71.6(C3)，121.0(C6)，141.0(C5)，165.8(C17)，182.9(C=S); IR ν:3 424，2 925，1 644，1 539，1 464，1 364，1 260，1 118，1 053，908，734 cm－1; HR-EI-MS m/z:Calcd for C22H36N3OS{［M +H］+}390.257 9，found 390.258 6。

N，N-二甲基孕甾-20-缩氨硫腙(2):产率42%，m.p.217℃～218℃;1H NMR δ:0.67(s，3H，18-H)，1.02(s，3H，19-H)，1.26(s，3H，21-CH3)，3.31(s，6H，NCH3)3.48～3.59(m，1H，3-Hα)，5.36(d，J=4.8 Hz，1H，6-H);13C NMR δ:13.5(C18)，19.4(C19)，20.9(C21)，21.0(C11)，23.7(C15)，24.2(C16)，29.7(C2)，31.6(C8)，32.1(C7)，36.5(C10)，36.5(NCH3)，37.3(C1)，38.4(C12)，42.2(C4)，45.2(C13)，50.0(C9)，56.3(C17)，58.0(C14)，71.7(C3)，121.2(C6)，140.8(C5)，152.1(C20)，183.0(C=S); IR ν:3 424，2 925，1 726，1 504，1 384，1 314，1 254，1 122，1 050，908，726 cm－1; HR-EI-MS m/z:Calcd for C24H40N3OS{［M + H］+} 418.289 2，found 418.290 3。

N，N-二甲基雌酮-17-缩氨硫腙(3):产率37%，m.p.183℃～185℃;1H NMR δ:0.93(s，3H，18-H)，2.84～2.89(m，2H，16-H)，3.37(s，6H，NCH3)，6.61(s，1H，4-H)，6.69(d，J=8.4 Hz，1H，2-H)，7.15(d，J=8.4 Hz，1H，1-H);13C NMR δ:17.1(C18)，23.2(C11)，26.1(C15)，27.1(C16)，29.5(C7)，29.7(C6)，34.1(C12)，38.1(NCH3)，40.0(C8)，44.0(C9)，45.0(C13)，52.6(C14)，112.9(C2)，115.3(C4)，126.4(C1)，132.0(C10)，138.0(C5)，153.7(C3)，166.0(C17)，182.7(C=S); IR ν:3 411，2 925，1 731，1 606，1 539，1 499，1 372，1 257，1 095，921，816，724 cm－1; HR-EI-MS m/z:Calcd for C21H30N3OS{［M + H］+} 372.211 0，found 372.211 7。

3，5-二羟基-N，N-二甲基-B-降胆甾-6-缩氨硫腙(4):产率58%;1H NMR δ:0.67(s，3H，18-H)，0.86(d，J=6.6 Hz，6H，26，27-H)，0.91(d，J=6.0 Hz，3H，20-H)，0.92(s，3H，19-H)，2.02(m，2H，4，8-H)，2.16(t，J=8.1 Hz，1H，7-H)，3.33(s，6H，NCH3)，4.10(br s，1H，3-H)，7.21(d，J=6.8 Hz，1H，6-H);13C NMR δ:12.5(C18)，18.6(C19)，18.8(C21)，21.6(C11)，22.5(C27)，22.8(C26)，23.8(C23)，24.6(C15)，27.9(C25)，28.0(C16)，28.5(C2)，35.6(C1)，36.2(C20)，39.5(C22)，39.7(C4)，43.0(C24)，43.2(C12)，43.0(NCH3)，43.7(C10)，44.7(C8)，45.2(C13)，51.3(C9)，53.4(C7)，55.6(C14)，56.2(C17)，67.1(C3)，83.7(C5)，150.7(C=N)，181.0(C=S); IR ν:3 422，2 940，2 866，1 719，1 614，1 547，1 467，1 377，1 365，1 270，1 235，1 123，1 078，1 016 cm－1; HR-EIMS m/z:Calcd for C30H54N3O2S{［M + H］+}，found 520.393 7。

1.3抗肿瘤活性测定

以顺铂为阳性对照，采用MTT法测定了1～4 对HepG，CNE-2和HEK-293T的体外生长增殖抑制活性。将对数生长期的细胞分别以(3～4)×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔接种200 μL，置CO2培养箱中培养24 h。按预设的浓度梯度分别加入待测样品，每一个浓度梯度设3个平行孔，同时设对照孔和空白孔。保持37℃在CO2培养箱中培养72 h。每孔加入20 μL的MTT(5 mg· mL－1)溶液，再于CO2培养箱中温育4 h。弃去上清液，加入DMSO 200 μL，混匀10 min，待沉淀完全溶解后，用酶标仪在490 nm处测定溶液的OD值，计算一定浓度下化合物对细胞的抑制率;以抑制率对药物浓度作图，分别求出每个样品的IC50值。

2　结果与讨论

2.1合成与表征

从去氢表雄酮、孕烯醇酮和雌酮出发，其17-位或20-位羰基与N，N-二甲基硫代氨基脲发生缩合反应，引入N，N-二甲基氨基硫腙基团，合成了1～3。

1的1H NMR分析表明，δ 3.33处单峰为6个氢［N(CH3)2，此处与氮原子相连的两甲基是等位的，故表现为一个单峰］，δ 7.87处的宽单峰是与氮相连氢的吸收峰。13C NMR分析表明，δ 182.9处出现C=S吸收峰，δ 165.8处出现C=N吸收峰，去氢表雄酮17-位羰基碳在δ 220处的吸收峰消失，均表明去氢表雄酮中的17-羰基已与N，N-二甲基硫代氨基脲缩合合成了1。2和3的表征与1类似。

4的1H NMR分析表明，δ 7.21处的吸收峰是与氮相连6-位氢吸收峰，δ 4.10处的吸收峰是与羟基相连3-位氢吸收峰，δ 3.33处的单峰是与氮相连的两个甲基的6个氢吸收峰。13C NMR分析表明，δ 67.1和δ 83.6吸收峰分别是与羟基相连的C3和C5;δ 180.9处吸收峰归属C=S，δ 150.7处吸收峰则归属C=N，进一步结合质谱数据可确定4的结构。

2.2抗肿瘤活性

1～4的抗肿瘤活性见表1。由表1可见，1～4对所测试的肿瘤细胞株均具有一定的抑制生长增殖活性，其中1对CNE-2的IC50为15.4 μmol· L－1，优于阳性对照物顺铂; 2对HepG的IC50为

表1　化合物的抗肿瘤活性*Table 1　Anti-tumor activities of compounds

10.7 μmol·L－1。有趣的是具有17-缩氨硫腙结构的化合物1和3对HEK-293T没有明显的细胞毒性，值得进一步深入研究。

3　结论

以具有不同甾核结构特征的甾酮或甾醛作为原料，合成了4个具有不同结构特征的N，N-二甲基甾体缩氨硫腙类化合物。抗肿瘤活性研究结果表明:所有化合物对所测试的肿瘤细胞都表现出明显的生长增殖抑制活性。其中，具有17-缩氨硫腙结构的化合物对人肾上皮正常细胞HEK-293T没有表现出明显的抑制活性。以上结果为新的甾体抗肿瘤药物的设计合成提供参考。

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Synthesis and Anti-tumor Activities of
Novel Steroidal N，N-dimethylthiosemicarbazone Compounds

HUANG Yan-min，ZHENG Jia-hua，ZHAO Dan-dan，QI Bin-bin，YANG Chun-hui，SHENG Hai-bing，GAN Chun-fang，CUI Jian-guo
(College of Chemistry and Materials Science，Guangxi Teachers Education University，Nanning 53001，China)

Abstract:Four novel N，N-dimethylthiosemicarbazone compounds(1～4)were synthesized by condensation reaction of dehydroepiandrosterone，pregnenolone，estrone，3，5-dihydroxy-6-formyl-B-norcholestane with N，N-dimethylthiosemicarbazide，respectively，using EtOH(or MeOH)as solvent and HAc as catalyst.The structures were characterized by1H NMR，13C NMR，IR and HR-EI-MS.The anti-tumor activities of 1～4 against human hepatoma cells(HepG)，nasopharyngeal carcinoma cells(CNE-2)and normal kidney epithelial cells(HEK293T)were investigated by MTT method.The results showed that 1～3 had better antiproliferative activities against HepG and CNE-2.

Keywords:sterone; 3，5-dihydroxy-6-formyl-B-norcholestane; steroidal N，N-dimethylthiosemicarbazon; synthesis; anti-tumor activity

作者简介:黄燕敏(1973－)，女，汉族，广西隆安人，博士，教授，硕士生导师，主要从事甾体化合物的制备和抗肿瘤活性研究。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(21462009);南宁市科技开发项目(20145203)

收稿日期:2015-09-09

DOI:10.15952/j.cnki.cjsc.1005－1511.2015.12.1106 *

文献标识码:A

中图分类号:O629.21; R914.5