抗真菌肽Drosomycin在原核生物表达系统中的可溶性表达

吴文梅 李彩婷 杨婉莹*

（华南农业大学动物科学学院，广州 510642）

真菌是生物界中很大的一个类群，现已发现对人类有致病性的真菌约有300多个种类[1]。市面上所用抗真菌类药物，副作用大，易产生抗药性[2]。而抗真菌肽却有望解决这些弊端。

抗真菌肽Drosomycin来自于果蝇，属于天然蛋白质，相对分子质量小，热稳定性好，遇水易溶解，可作为抗生素的替代品，为我们解决抗生素耐药性提供新材料[3][4]。杨婉莹等从2002年开始对抗真菌肽及其家族蛋白的研究，结果表明Drosomycin对丝状病原真菌具有广谱的抑制活性，可以作为新的抗真菌药物的靶标[5][6][7]。但Drosomycin在果蝇体内含量极微，天然资源有限，提取步骤烦琐、成本高，得率低，不利于工业生产[8]。因此利用分子生物学技术进行体外表达成为研究热点。

Drosomycin成熟肽包括44个氨基酸，其中8个半胱氨酸形成4对二硫键，由于结构的复杂性，在利用原核系统表达该蛋白时往往形成包涵体，后续纯化复性步骤复杂，不利于实际利用。本实验利用大肠杆菌原核生物表达系统，通过对冷休克表达载体pcold TF进行改造，实现Drosomycin体外的可溶性表达，为下一步生产应用奠定基础，同时为探索富含二硫键的蛋白在体外的分离纯化提供一条线索。

1 材料与方法

1.1 材料，质粒

果蝇细胞sf9由本实验室保存,大肠杆菌E.coli（DH5α）感受态细胞，BL21（DE3）感受态细胞均购自北京天根生物公司；质粒pCold TF由崔玉宝教授赠送。

1.2 酶类及其他试剂

胰蛋白胨（Tryptone）、酵母抽提物（Yeast Extract）、氯化钠（NaCl）为上海生物生工有限公司产品；氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）、X-gal、预染蛋白Marker购自广州翔博生物技术有限公司；蛋白质 Maker、RNA酶A，Western blot膜封闭液购自北京天根生物公司；Trizol Reagents总RNA抽提试剂盒，各规格DNA Marker、限制性内切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)、PCR聚合酶、反转录用试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）、T4 DNA ligase、pMD19-T 载体、Primer-STAR DNA 聚合酶、dNTP Mixture（各 10 mmol/L）均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；鼠抗Penta-His抗体购置碧云天生物技术有限公司；HRP-兔抗鼠结合物购自北京全式金生物技术有限公司；Ni-NTA亲和层析填料镍购自伯乐生物科技有限公司。其他化学试剂均是国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 果蝇细胞sf9的DNA提取

取实验室培养的果蝇细胞sf9,待平板长到80%-90%时，加入Trizol裂解细胞，随后将平板中的细胞转入1.5 ml的EP管中，按照常规方法氯仿/异丙醇步骤变性蛋白质，抽提其RNA[9],最后利用试剂盒将其反转录成DNA，于-20℃保存。

1.3.2 抗真菌肽Drosomycin基因的PCR扩增

根据 NCBI上已登录 (NM079177)的Drosomycin(Drs)基因序列设计了一对引物，上游引物 Drs-F:5’-CGCCATATGGACTGCCTGTCCGG-3’（横线所示为NdeⅠ酶切位点），下游引物 Drs-R:5’-CCGCTCGAGTTAGCATCCTTCGCA-3’（横线所示为 XhoⅠ酶切位点），引物由上海生物生工有限公司合成。

以抽提果蝇的DNA为模板，用上述引物扩增Drs编码基因，PCR反应体系包括TaKaRa Taq （5 U/μl） 0.25 μl；10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）5 μl；dNTP Mixture（各2.5 mM） 4 μl；上游引物（20 μM）1 μl；下游引物（20 μM） 1 μl；cDNA First-strand 1μl，添加灭菌ddH2O至总体积为50 μl。PCR反应：预变性98℃ 5 min，变性98℃30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，32个循环，延伸72℃ 10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用天根胶回收试剂盒切胶回收目的基因。

1.3.3 重组载体pCold TF-Drs的构建

质粒pCold TF和体外扩增的目的基因Drs用限制性内切酶Nde I和XhoI进行双酶切，50 μl酶切体系为：质粒DNA/Drs 30 μl，10xH bueffr 5 μl，XhoI 2.5 μl，NdeI 2.5 μl，加 ddH2O 10 μl补足 50 μl酶切体系，37℃酶切8 h。1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，在紫外灯下用无菌手术刀片切下线状载体DNA和PCR产物的条带，按胶回收试剂盒说明书操作，回收目的载体片段和PCR产物。将Drs的酶切纯化产物和表达载体pCold TF的酶切纯化产物于16℃连接8 h，反应体系10 μl：PCR纯化产物5 μl，pCold TF 酶切产物 3 μl，T4 ligase 1 μl，T4 ligase buffer 1 μl. 然后转化进大肠杆菌DH 5α感受态细胞。将通过菌液PCR鉴定成功的重组质粒送上海生工测序。

1.3.4 重组载体pCold TF-Drs的诱导表达及SDS-PAGE鉴定

将测序正确的pCold TF-Drs转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,利用含有Amp(氨苄青霉素)抗性的平板筛选阳性重组子。将筛选成功的含有pCold TF-Drs重组菌BL21(DE3)单菌落,接种到LB培养基中,37℃培养箱过夜振荡培养，然后取菌液按1:100体积比转接LB培养基，37℃振荡培养3 h至 OD600nm=0.4-0.5左右，添加IPTG 0.5 mM进行诱导表达，15℃培养24 h。收集细菌，用适量PBS重悬后进行超声破碎，超声6 s,间隔10 s,超声90次，菌体破碎液用低温离心机进行收集，10 000 r/min，4℃，离心30 min，分别取全蛋白、超声破碎上清、超声破碎沉淀各16 μl,加入4 μl 5X SDS loading buffer,100℃加热10 min变性蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳，结束后用考马斯亮蓝G250染色。

1.3.5 Western blot鉴定

按上述方法进行SDS-PAGE,然后将蛋白转至PVDF膜,电泳仪参数设置为电压100 V，70 min,将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉中，至摇床上室温封闭30 min；倒出封闭液，加入4 ml脱脂奶粉稀释的一抗（抗His标签鼠单抗），稀释比例为1:1 000，尽可能排除气泡，于摇床4℃杂交过夜。使用后回收一抗；去除一抗后将膜用20 ml TBST清洗3次，每次置于摇床清洗10 min；将膜置于新的平皿中，加入4 ml脱脂奶粉稀释的二抗（HRP标记山羊抗小鼠IgG），稀释比例为1:1 000，至摇床上室温孵育2 h以上；去除一抗后将膜用20 ml TBST清洗3次，每次置于摇床清洗10 min；将洗好的PVDF膜置暗房中，滴加发光液进行化学发光显色，X光胶片曝光显影定影后保存胶片。

1.3.6 融合蛋白的分离纯化

重组融合蛋白的纯化是通过Ni-NTA亲和层析柱完成，具体过程主要包括以下步骤：先取一定量的Ni-NTA填料，加到柱子里，用10个柱体积的PBS对柱子进行洗涤与平衡；盖紧下面的帽子，取超声破碎的上清加入到柱子中，盖紧上面的帽子，4℃，旋转混匀30 min；固定柱子，摘掉两个帽子，让溶液全部自然流下，收集样品，用于检验；用含有25 mM咪唑的PBS清洗柱子，直到OD280没有变化时，停止洗涤；分别用含有25 mM，50 mM，100 mM，150 mM，300 mM 咪唑 Tris洗脱柱子上的目的蛋白，收集蛋白，通过SDS-PAGE进行染色检测是否干净；用含有1 M咪唑的Tris，清洗柱子，使柱子上的蛋白完全洗下来；用0.5 M NaOH清洗柱子；用20%酒精保存柱子。分别检验不同浓度的咪唑洗脱液中的蛋白，取收集的各管蛋白制样，进行SDS-PAGE检测，检测洗脱目的蛋白的最适咪唑浓度。

2 结果与分析

2.1 重组载体pCold TF-Drs的构建

以果蝇的DNA为模板，PCR扩增目的基因Drosomycin，电泳检测目的条带符合预期大小（图1）。切胶回收目的条带，酶切后连接到pCold TF载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（图2），将构建成功的重组载体pCold TF-Drs送上海生物生工公司测序，结果与预期的一致。

2.2 质粒pCold TF-Drs原核表达及鉴定

取测序成功的重组质粒pCold TF-Drs转化BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落培养至OD600为0.4用IPTG进行诱导，15℃培养24 h，离心收集菌体超声破碎，收集样品进行SDS-PAGE电泳，并进行Western-blotting检测，结果如图3、图4所示。从图中可以看出融合蛋白TF-Drs表达的蛋白质相对分子质量大小为60 ku(所含Drs为5 ku)，与预期结果一致。Western blot结果也显示携带His标签的融合蛋白可以与鼠抗Penta-His抗体识别。

2.3 融合蛋白pCold TF-Drs的分离纯化

将15℃表达的细菌裂解液上清，通过Ni-NTA柱亲和层析纯化，洗脱咪唑浓度梯度依次为20 mM、40 mM、60 mM、300 mM。分别取每个浓度梯度的洗脱液，进行12%SDS-PAGE检测，检测结果如图5所示，可见：细菌裂解液上清中呈可溶性表达，融合蛋白pCold TF-Drs在Ni-NTA柱洗脱咪唑浓度为300 mM时，洗脱纯化效果最好。经Ni-NTA柱亲和层析纯化，获得300 mM咪唑的洗脱液，进一步使用分子筛SephadexP-10层析柱去除咪唑和脱盐。脱盐后的融合蛋白再使用10 KDa的超滤管进行超滤浓缩，获得的融合蛋白pCold TF-Drs经SDS-PAGE检测，表明融合蛋白得到很好的纯化(图6)。

图1 目的基因Drs扩增电泳图

图2 pCold TF与Drs双酶切回收电泳图

图3 融合蛋白TF-Drs的SDS-PAGE检测

图4 融合蛋白TF-Drswestern blot检测

图5 融合蛋白TF-Drs的Ni-NTA纯化

图6 融合蛋白TF-Drs的脱盐纯化

3 讨论与结论

大肠杆菌原核生物表达系统由于其生长周期短，生长速度快，转化外源DNA操作简单，可以大规模发酵培养，被认为是一种体外合成重组蛋白最简单的外源表达系统，但是多数情况下外源表达产物形成非活性的包涵体蛋白，不利于后续实验[10]。本实验室前期构建过pET 3C-Drs表达质粒，转化进大肠杆菌BL21（DE3）后，目的蛋白主要以包涵体的形式表达，需要变性，复性，不利于生产操作[11]。pCold TF-Drs作为表达载体与pET系列载体对比而言，它具有TF标签可以促进目的蛋白的可溶性表达，纯化简单，标签容易移除。同时，它还是是一个低温冷休克表达载体，表达目的蛋白稳定[12]。

通过本次实验，确定了将目的基因抗真菌肽Drosomycin定向克隆到原核生物表达载体pCold TF后，将构建正确的重组载体pCold TF-Drs转化大肠杆菌 BL21(DE3)，IPTG诱导外源蛋白表达，SDS-PAGE电泳检测发现获得的目的蛋白相对分子质量单位为60 kDa，与预期值（55 kDa+5 kDa=60 kDa）相一致。Western Blot结果也表明，该蛋白可被鼠抗His抗体识别，表明在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达的蛋白是目的蛋白。通过超声破碎 pCold TF-Drs转化菌（BL21），用SDS-PAGE显示其大部分在上清中，表明是可溶性表达。

本实验成功构建了重组质粒pCold TF-Drs,实现了目的蛋白在原核生物表达系统中的可溶性表达，为下一步酶切纯化出抗真菌肽Drosomycin实现生产上的利用，对植物类病原真菌的抑菌活性检测，药理药效的研究以及开发抗真菌药物奠定了基础。

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