格尔德霉素（GDA）能导致小麦基因组DNA多态性和甲基化修饰增加

王 闪， 郑禹轩， 刘冬杪， 张彩云， 张飞雄

（首都师范大学生命科学学院， 北京100048）

热休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp 90）是在真核和原核细胞中都普遍存在的一组高度保守的分子伴侣，能对细胞中众多信号蛋白的构象成熟、功能稳定［1］及向细胞器的转运等过程进行调控［2］。近些年研究发现，Hsp 90在细胞恶性转化和转移［3，4］、参与异染色质区的基因沉默调控［5］等方面都发挥着重要的作用，已成为新型的抗肿瘤药物作用靶点［6］。为了探讨Hsp 90作用的机理，众多Hsp 90的抑制剂也逐渐被发现。Hsp 90抑制剂按照结合位点的不同可大体分为N－末端抑制剂、C－末端抑制剂以及结合位点未明确的抑制剂三大类［1］。

格尔德霉素（geldanamycin，GDA）最初是从吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中分离得到的天然产物，是第一个被发现的Hsp 90N－末端抑制剂，属于苯醌安莎类抗生素，体外具有抗病原虫以及很好的抗肿瘤活性［7］。格尔德霉素通过竞争性结合Hsp 90N－末端的ATP／ADP结合位点，改变Hsp 90构象，使其不能与效应蛋白及其他小分子蛋白形成复合体，从而抑制其行使正常的功能并最终导致细胞的凋亡及细胞周期的停滞［8］，可作为生化调节剂应用于肿瘤联合化疗［9］。然而这些结论大部分是以动物和人为对象研究获得的。有证据表明，GDA也会影响到植物的生长、形态发生等方面［10］，因此本研究选取小麦为实验对象。

随机扩增多态性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是在PCR基础上建立的以一系列随机排列顺序的寡聚核苷酸单链为引物对所研究的基因组DNA进行多态性分析的分子技术。它能较好地反映基因组相应区域的DNA多态性，具有快速、准确、多态性 检 出 率 高 等 特 点［11，12］，在 分 类 学［13］、遗 传 育种［14］等研究中都发挥着重要作用。

双限制性内切酶酶切－随机扩增技术（Coupled Restriction EnzymeDigestion－Random Amplification，CRED－RA）是在RAPD技术的基础上，利用HpaII与MspI对同一识别位点间敏感性不同，通过分析HpaII－MspI作用后的电泳谱带的差异来检测DNA的甲基化修饰［15］，该技术被广泛应用于DNA甲基化的检测以及遗传连锁图谱的构建等方面［16］。

本实验以小麦为材料，经GDA处理后发现根的生长受到抑制，在此基础上运用RAPD和CRED－RA从分子水平上对其作用机制进行了探讨。

1 材料和方法

1.1 实验材料及GDA处理

实验材料为普通小麦（Triticum aestivumL.）品种CB 037－A。选取大小相近、颗粒饱满的小麦种子用自来水浸泡吸胀1h后，放到铺有湿润滤纸的培养皿中，于23℃下避光过夜萌发。将萌发露白的种子用150μmol／L GDA（Selleckchem 公司产品，DMSO 溶解配制）溶液避光处理24h；对照组用自来水处理相同时间。

1.2 DNA提取及RAPD和CRED－RA分析

1.2.1 DNA提取

植物基因组DNA提取试剂盒购于康为世纪（CW 0553）并按照说明书步骤提取小麦根尖细胞基因组总DNA（gDNA），于－20℃保存备用。

1.2.2 RAPD分析

本 次 实 验 使 用 的 引 物 为 OPA－05、OPA－10、OPD－08、OPJ－01、OPK－08、OPO－05、A.z 09、S 32、S 126、S 127，由上海生工合成（序列见表1）。

PCR反应体系：10×PCR 缓冲液 （含 Mg2＋）2μL，dNTP混合液0.2μL，Taq酶1U，10bp随机引物20pmol，DNA 模板15ng，用 Milli Q 水补齐至20μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min，再以94℃变性1min、36℃退火1min、72℃延伸2min，共循环45次，最后72℃再延伸10min。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Takara公司的500bp DNA分子量标准，以Bio－Rad公司的电泳成像系统检测拍照。

1.2.3 CRED－RA分析

取1μg gDNA分别用1μL HpaII和1μL MspI于37℃酶切2h。然后使用艾德莱公司生产的DNA纯化试剂盒（DR 02）将酶切产物纯化。PCR体系、反应程序及所用引物均与RAPD的分析相同。

表1 用于RAPD与CRED－RA分析的随机引物序列

2 结果与分析

2.1 GDA处理对小麦根生长的影响

图1是150μmol／L GDA处理24h后小麦根尖生长的照片，可以看出，处理组根的长度不到对照组的一半，很显然小麦根的生长受到严重抑制。

图1 GDA处理后小麦根尖的生长状况

2.2 GDA处理导致gDNA的多态性增加

gDNA的多态性包括条带的增加和减少、亮度的变化等差别［17－18］。

10种随机引物的扩增结果显示，对照组gDNA共扩增出53条带，处理组条带数目增加了2条，分别由OPA－05、OPK－08两个引物扩增出；没有条带数目减少的情况发生（表2，图2）。与此同时，条带明亮程度出现差异，表现在引物OPA－05扩增后有4条带变亮；而OPK－08的扩增产物有1条带变暗（表3，图2）。

图2 GDA处理的小麦根尖细胞基因组DNA以S 127、OPA－05和OPK－08为引物的RAPD电泳图谱

总体而言，GDA处理后，小麦gDNA有7条多态性差异。

表2 小麦根端细胞经150μmol／L GDA处理后的RAPD条带与对照组相比条带数目的变化

2.3 GDA处理引起DNA甲基化增加

比较对照组与处理组CRED－RA电泳图，发现存在有2种类型的条带（1，2）变化现象（图3）。OPA－05扩增条带中具有类型1的变化，表明经150μmol／L GDA处理后，DNA能被MspI切割，不能被HpaII切割；而对照组DNA两种酶都能切割，说明此处本没有甲基化的DNA转变成了内部甲基化修饰。S 32的扩增产物中出现类型2的变化，表明经处理后DNA只可被MspI所切割，不能被HpaII切割；而对照组DNA这两种酶都不能切割，说明在这一区域DNA由原来的外部甲基化修饰转变为内部甲基化修饰。

表3 小麦根端细胞经150μmol／LGDA处理后的RAPD条带与对照组相比条带明暗的变化

实验结果表明，经GDA处理后的小麦根尖细胞基因组DNA甲基化水平有所增加。

3 讨 论

早前有关GDA调节生物生长、发育、基因表达和凋亡等作用多是在动物和人中研究获得的，该抑制剂在植物中的作用报道很少。Kozeko的研究结果显示，GDA能抑制拟南芥幼苗的生长和形态学发生［10］。

本实验用150μmol／L GDA溶液处理萌发的小麦根尖，证实根的生长确实受到抑制。为了探讨其作用机制，应用RAPD和CRED－RA方法进行了检测，结果表明，GDA处理后小麦基因组DNA有7条的多态性差异；同时出现了2种类型的DNA甲基化修饰现象，它们分别说明原先没有甲基化的DNA转变成了内部甲基化修饰，原先为外部甲基化修饰的DNA转变成了内部甲基化修饰。由于DNA的甲基化修饰会导致产生沉默基因，抑制其转录活性［19］，因此GDA处理后小麦根尖的生长受到抑制就不难理解了。

本研究首次从分子水平和表观遗传学水平上揭示了GDA导致植物生长受到抑制的作用机理。

图3 以 OPA－05、S 32作为引物的CRED－RA电泳图谱

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