人脐带间充质干细胞移植治疗缺血缺氧性脑病的有效性

·论著·

人脐带间充质干细胞移植治疗缺血缺氧性脑病的有效性

王彦永，王铭维

作者单位：050031河北省石家庄市，河北医科大学第一医院神经内科

通信作者：王铭维，050031河北省石家庄市，河北医科大学第一医院神经内科；E-mail：mwwang2007@hotmail.com

【摘要】目的探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)移植治疗缺血缺氧性脑病(HIE)的有效性。方法选取2012年12月—2013年12月河北医科大学第一医院收治的HIE患者25例为研究对象，根据患者意愿将患者分为对照组(15例)和移植组(10例)。两组患者均进行常规基础临床处理，包括脱水降颅压、营养神经及高压氧、针灸、功能训练等。于本院妇产科健康足月胎儿的脐带中提取并分离培养hUCMSCs，采用流式细胞仪进行细胞免疫表型鉴定。移植组患者通过外周静脉滴注移植hUCMSCs 1.0×107个/次，移植3次，每次间隔1周。两组患者分别在治疗前及治疗结束后14、90、180 d采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、Barthel指数量表、帕金森病统一评分量表(UPDRS)、汉密尔顿抑郁14项量表(HAMD14)、汉密尔顿焦虑24项量表(HAMA24)及简易精神状态检查量表(MMSE)评价各项功能。结果治疗前，两组患者NIHSS、Barthel指数、UPDRS、HAMD14、HAMA24及MMSE评分比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。不同干预对两组各量表评分的影响比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且干预与时间对两组各量表评分的影响存在交互作用(P<0.05)。移植组患者hUCMSCs移植过程及移植后72 h内均未出现发热、血压改变、过敏反应。结论hUCMSCs移植可改善HIE患者神经功能、锥体外系功能、情绪反应及认知功能。

【关键词】缺血缺氧，脑；脐血干细胞移植；间质干细胞

基金项目：河北省科技计划项目(12276102D)

【中图分类号】R 743

收稿日期：(2015-03-24；修回日期：2015-08-20)

王彦永，王铭维.人脐带间充质干细胞移植治疗缺血缺氧性脑病的有效性[J].中国全科医学，2015，18(35)：4293-4297.[www.chinagp.net]

Wang YY，Wang MW.Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation on the treatment of hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Chinese General Practice，2015，18(35)：4293-4297.

Effects of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Transplantation on the Treatment of Hypoxic-ischemic EncephalopathyWANGYan-yong，WANGMing-wei.DepartmentofNeurology，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050031,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the efficacy of human umbilical cord mesenchymal stem cell(hUCMSCs) transplantation on the treatment of hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE).MethodsWe enrolled 25 HIE patients who received treatment in the First Hospital of Hebei Medical University from December 2012 to December 2013.According to the will of the patients,we divided them into control group(n=15) and transplantation group(n=10).The two groups of patients were all administrated with conventional basic clinical treatment,including intracranial decompression by dehydrating agents,trophic nerve,high pressure oxygen,acupuncture and moxibustion,etc.hUCMSCs were extracted from the umbilical cords of full-term fetuses in the gynaecology and obstetrics department of our hospital and were cultured.Flow cytometry was employed to conduct immunophenotype identification of the cells.In transplantation group,the transplantation was conducted by 1.0×107per time for three times with one-week interval through peripheral intravenous drip.NIHSS,Barthel scale,UPDRS,HAMD14,HAMA24and MMSE were used to evaluate various functional parameters of the two groups before treatment,and 14 days,90 days and 180 days after treatment.ResultsBefore treatment,the two groups were not significantly different in the scores of NIHSS,Barthel scale,UPDRS,HAMD14,HAMA24and MMSE (P>0.05).The different intervention were significantly(P<0.05) in the influence on the scores of NIHSS,Barthel scale,UPDRS,HAMD14,HAMA24and MMSE,and there was interaction between intervention and time on the scores of above scales(P<0.05).Transplantation group didn′t occur fever,changes in blood pressure and allergic reaction when and within 72 h after transplantation.ConclusionTransplantation of hUCMSCs can significantly improve the neurological function,extrapyramidal function,emotional reaction and cognitive function.

【Key words】Hypoxia-ischemia,brain；Cord blood stem cell transplantation；Mesenchymal stem cells

间充质干细胞是Friedenstein等[1]于1966年首次发现的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。来源于新生儿脐带的间充质干细胞克服了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥难题，无道德伦理学限制，与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相比，高度病毒污染的风险极大降低，且不会随供体年龄的增长而出现细胞扩增、分化能力明显下降趋势，成为目前干细胞领域新的研究热点[2]。已有体外实验证实，在不同的诱导条件下，人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)不仅可向成骨、软骨、脂肪细胞等多种中胚层来源的组织细胞分化，还可向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化[3]。目前临床缺血缺氧性脑病(HIE)暂无有效的根治性干预措施，本研究采用hUCMSCs对临床HIE患者进行移植治疗，并进行6个月的随访，评价其有效性与安全性，现报道如下。

1对象与方法

1.2方法

1.2.1常规治疗两组患者均进行常规基础临床处理，包括脱水降颅压、营养神经及高压氧、针灸、功能训练等康复治疗。

1.2.2hUCMSCs的提取及分离培养hUCMSCs取自本院妇产科健康足月胎儿脐带，产妇分娩前体健，无HIV、乙型肝炎病毒、梅毒螺旋体等感染，并征得其知情同意。脐带采集后，置于无菌0.9%氯化钠溶液中，在4 ℃条件下迅速转移至无菌细胞房，采用组织块贴壁法进行原代干细胞的分离培养，操作在12 h内完成。将脐带外膜与血管剔除，取脐带沃顿胶剪碎接种于无血清培养基中，置于37 ℃，5% CO2孵箱进行培养，3 d后换液。培养第6～7天镜下可见贴壁生长的单个梭形细胞从组织块中游离出来，再次换液。培养第10～14 天，贴壁细胞融合至70%～80%，用0.1%胶原酶进行消化并传代。取第4代处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，分别加入抗体CD34-PE、CD44-PerCP-Cy5.5、CD45-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、HLA-DR FITC，流式细胞仪进行细胞免疫表型鉴定。台盼蓝染色鉴别活细胞，调整细胞悬液的浓度至1.0×105/ml。

1.2.3hUCMSCs移植移植组患者通过外周静脉滴注移植hUCMSCs 1.0×107个/次，移植3次，每次间隔1周。移植过程及移植后72 h内密切监测患者各项基本生命体征，并注意有无发热、血压升高、过敏等不良反应发生。

1.3临床评价两组患者分别在治疗前及治疗结束后14、90、180 d对各项功能指标进行评价。采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、Barthel指数量表评价其神经功能；采用帕金森病统一评分量表(UPDRS)的运动部分评价其锥体外系功能；采用汉密尔顿抑郁14项量表(HAMD14)、汉密尔顿焦虑24项量表(HAMA24)及简易精神状态检查量表(MMSE)评价情绪反应及认知功能。

2结果

2.1hUCMSCs鉴定结果hUCMSCs传至第4代生长良好，呈长梭形，具有典型的成纤维细胞形态(见图1)。流式细胞仪检测显示，hUCMSCs高表达间充质干细胞的标志CD44、CD73，不表达造血干细胞标志CD34、CD45及主要组织相容性复合体标志HLA-DR，说明hUCMSCs分离培养成功且免疫原性低。

2.2两组治疗前各量表评分比较治疗前，两组患者NIHSS、Barthel指数量表、UPDRS、HAMD14、HAMA24及MMSE评分比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

图1　 显微镜下见hUCMSCs呈典型成纤维细胞形态

Figure 1hUCMSCs showing typical fibroblast morphology under a microscope

2.3临床评价

2.3.1两组患者神经功能比较不同干预对两组NIHSS、Barthel指数量表评分的影响比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且干预与时间对两组NIHSS、Barthel指数量表评分的影响存在交互作用(P<0.05,见表2)。

2.3.2两组患者锥体外系功能比较不同干预对两组UPDRS评分的影响比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且干预与时间对两组UPDRS评分的影响存在交互作用(P<0.05,见表3)。

Table 1Comparison of score of each scale between the two groups before treatment

组别例数NIHSS评分Barthel指数量表评分UPDRS评分HAMD14评分HAMA24评分MMSE评分对照组1512.6±5.044.5±15.428.9±12.711.7±5.710.5±5.719.7±5.5移植组1013.1±6.643.5±19.928.0±14.411.1±5.910.6±5.818.4±9.1t值0.2160.1420.1650.2540.0430.447P值0.8310.8890.8710.8020.9660.660

注：NIHSS=美国国立卫生研究院卒中量表，UPDRS=帕金森病统一评分量表，HAMD14=汉密尔顿抑郁14项量表，HAMA24=汉密尔顿焦虑24项量表，MMSE=简易精神状态检查量表

表3　两组锥体外系功能比较 ±s，分)

2.3.3两组患者情绪反应及认知功能比较不同干预对两组HAMD14、HAMA24及MMSE评分的影响比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且干预与时间对两组HAMD14、HAMA24及MMSE评分的影响存在交互作用(P<0.05,见表4)。

表2　两组神经功能比较 ±s，分)

表4　两组情绪反应及认知功能比较 ±s,分)

2.4不良反应移植组患者hUCMSCs移植过程及移植后72 h内均未出现发热、血压改变、过敏反应，未出现特殊异常反应。

3讨论

hUCMSCs是临床移植治疗各种疾病新的干细胞来源，具有来源广泛、取材方便、免疫原性低、感染病毒的机会小、分化潜力大、增殖能力强、无道德伦理限制等诸多优点。目前，hUCMSCs向神经元方向分化的体外实验及将其用于神经系统疾病治疗成为临床研究的热点问题。

Wexler等[4]于2003年首次报道间充质干细胞在特定条件下可向神经元样细胞进行分化，为间充质干细胞的应用奠定了基础。Mitchell等[5]发现，hUCMSCs经诱导可形成神经元特有的尼氏体结构，并表达神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等神经特异性标志物。Ma等[6]发现hUCMSCs诱导后可表达神经干细胞的相关基因Nestin及Pleiotrophin，免疫组织化学染色可见神经胶质细胞(GFAP)和神经微管蛋白(β-Tubulin Ⅲ)及NF的阳性表达。

Weiss等[7]将hUCMSCs移植入帕金森病(PD)模型大鼠，12周后大鼠行为明显改善，双侧黑质和腹侧中脑均发现酪氨酸羟化酶阳性细胞。Fu等[8]将向多巴胺能神经元诱导后的hUCMSCs直接移植入PD模型大鼠纹状体内，观察大鼠阿扑吗啡诱导的旋转行为改善，移植4个月后发现移植细胞在大鼠脑内向头尾侧各迁移1.4 mm，说明移植细胞不仅可以存活，并具有正常细胞样的迁移功能。实验发现，hUCMSCs移植到脊髓损伤模型大鼠的损伤区头尾两侧，可刺激损伤区皮质脊髓束再生和增加损伤周围区轴突的数量，脊髓内胶质源性神经营养因子(GDNF)和神经营养因子-3(NT-3)表达增高，大鼠运动功能明显增强[9]。国内有报道将hUCMSCs移植入脊髓损伤模型大鼠中，28 d后在大鼠脊髓发现移植细胞迁移、聚集于损伤组织的周围，NSE与GFAP阳性细胞的比例分别为3.6%和12.7%[10]。Ding等[11]将hUCMSCs移植入卒中模型大鼠，大鼠神经功能改善，移植细胞分化为神经元、血管内皮细胞及GFAP，神经营养因子表达及局部脑皮质血流量增加，皮质神经元活性提高。国内有研究学者已初步将hUCMSCs移植应用于临床其他疾病的治疗并进行短期的随访，取得了一定的疗效[12]。

上述动物实验可见，hUCMSCs移植具有神经保护作用，一方面可能是其分化替代机制，通过替代原损伤、凋亡或坏死的神经元改善神经功能；另一方面，hUCMSCs可能通过细胞接触并抑制外周血淋巴细胞分泌细胞因子从而抑制T细胞、B细胞、NK细胞的增殖发挥免疫调节作用；通过减少损伤区域白细胞的浸润及下调小胶质细胞的活性而减轻炎症损伤[13]；通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)促进新生血管的生成或在出血区周围直接分化为血管内皮细胞；通过在局部损伤微环境中分泌多种神经营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF)、GDNF、NT-3等促进内源性神经干细胞的活化、移行及分化，多种途径共同作用，激活机体本身的内源性修复发挥保护作用。

本研究结果显示，将体外培养的hUCMSCs通过静脉滴入的方法植入HIE患者，采用各量表分别对其神经功能、锥体外系功能、情绪反应及认知功能进行评价，通过移植后14 、90及180 d随访，移植组患者各项功能均优于对照组，且无明显不良反应，提示hUCMSCs治疗HIE安全有效，为未来临床进一步扩大应用提供依据。

本研究也存在一定局限性，样本量较少，设立的对照组仅限于未进行移植的患者，而未进行蛛网膜下腔注射等其他途径治疗方式的比较；临床医生可能对移植组患者的常规治疗更加重视，从而夸大hUCMSCs的治疗效果。未来对hUCMSCs治疗HIE的效果仍需长期、大样本、多途径移植的研究，并深入探讨其相关机制，为改善患者的预后提供新的治疗方法。

参考文献

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(本文编辑：吴立波)